金釵石斛生物總堿對脂多糖激活星形膠質細胞產生炎癥因子的影響

張俊青，吳 芹，龔其海，張 鋒，金 鳳，聶 晶，石京山

(1.遵義醫學院藥理學教研室，貴州基礎藥理重點實驗室，貴州遵義 563000;2.濟寧市精神病防治院，山東 濟寧 272051)

炎癥反應在阿爾采末病(Alzheimer’s disease，AD)、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、腦缺血和中風(stroke)等中樞神經系統退行變疾病的發病過程中扮演著重要的角色，甚至成為很多原發病發展的主要原因［1］。

星形膠質細胞是中樞神經系統的免疫吞噬細胞，在致炎因素作用下被激活成反應性星形膠質細胞。激活的星形膠質細胞具有吞噬功能，并增加分泌細胞因子如白介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)及 NO 等，這些物質對神經細胞有毒性作用，使神經細胞凋亡并壞死［2－3］。

脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌內毒素的主要成分，研究表明LPS可以誘導星形膠質細胞激活，通過細胞因子TNF-α、IL-6的釋放引起炎性反應，從而導致各種病理狀態。

石斛(Dendorbium nobile)在我國傳統醫學中名貴中藥材。有研究表明，石斛提取物能明顯抑制LPS 誘導的星形膠質細胞分泌 IL-6、TNF-α、NO［4］。本實驗室前期研究發現金釵石斛生物總堿對原代培養的大鼠神經元具有保護作用，并發現其在神經藥理活性方面具有積極作用［5］。

本課題觀察了金釵石斛生物總堿對LPS誘導的大鼠大腦皮層星形膠質細胞的激活，及其產生和釋放TNF-α、IL-6的影響及其可能的機制，利用MTS法檢測培養的細胞生存率;ELISA法檢測TNF-α炎性因子蛋白的表達，通過實時熒光定量PCR(real time RT-PCR)測定TNF-α、IL-6 mRNA水平，進而為金釵石斛的進一步研究提供基礎藥理學依據。

1 材料

1.1實驗動物清潔級(SPF級)Sprague-Dawley(SD)大鼠種鼠25只，購自第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心(合格證書號渝SCXK20070005)。

1.2主要試劑和藥品金釵石斛生物總堿由遵義醫學院基礎藥理貴州省重點實驗室提取;脂多糖(批號78K4044)購于Sigma(上海)貿易有限公司;TNF-α ELISA試劑盒，上海西塘生物科技有限公司;β-actin、TNF-α、IL-6 引物、RNA 逆轉錄盒、熒光混合物購于美國ABI公司產品。

1.3主要儀器和設備SL SHELNB CO2孵箱為美國產品;IDGCJ-0.5超凈工作臺由上海先鋒電器廠制造iCycler熒光定量PCR儀為BIO-RAD美國產品;逆轉錄儀由德國Eppendorff制造;通用全自動酶標儀由美國Bio-Rad公司制造。

2 方法和觀察指標

2.1大鼠大腦皮質星形膠質的培養取新生3 d的SD大鼠，體積分數為70%乙醇消毒3次，無菌條件下取出大腦，將大腦皮質放入D-Hank's液中，剪成1 mm3左右的小塊，200目篩網過濾。用機械吹打法逐步移取上清液中的單細胞，4℃、1500 r·min－1、10 min，棄上清液取沉淀，用含 20% 胎牛血清，100 kU·L－1青霉素和鏈霉素的DMEM制成懸液后，調節細胞密度為1×105·L－1，接種于L-多聚賴氨酸包被12 h的25 cm2培養瓶中，移入5%CO2培養箱37℃培養。0.5 h差速貼壁兩次后，將培養液移入新培養瓶去除成纖維細胞，靜置培養，3 d后換液。培養9～14 d待細胞融合后傳代。

2.2實驗分組金釵石斛生物總堿實驗隨機分為5組:正常組，模型組，低、中、高劑量組(0.025、0.25和2.5 mg·L－1)。準確稱取脂多糖(LPS)2 mg，溶于2 ml生理鹽水中，配成1 g·L－1的母液，－20℃冰箱保存。臨用時用無胎牛血清的DMEM/F12培養液稀釋成終濃度為10 μg·L－1。取培養2～3代生長狀態良好的細胞加入脂多糖作用細胞6 h，正常組加入等量的培養基。再分別加入不同劑量的石斛生物總堿作用24 h，取上清液檢測指標。

2.3MTS檢測細胞的存活率用 MTS(即 MTS Reagent Powder和PMS的混合溶液)檢測細胞生存率。每孔加入100 μl含5%胎牛血清的培養液進行同步化培養24 h，棄培養液，每孔加入90 μl含不同濃度藥物的培養液培養24 h，最后每孔加入10 μl的MTS溶液，37℃ 95%空氣+5%CO2孵箱培養4 h。酶標儀測定各孔的吸光度值(absorbance，A)。

2.4ELISA法檢測TNF-α蛋白的含量星形膠質細胞傳2～3代后進行分組，藥物處理后，收集細胞培養上清液，1 500 r·min－1，4℃，離心 10 min，分裝，－80℃凍存。取上清采用TNF-α檢測試劑盒說明書所示的操作方法，用酶標儀測定樣品在450 nm的吸光度值(A450值)。

2.5Real time RT-PCR定量分析檢測TNF-α、IL-6 mRNA的含量引物制備:分別參照GenBank基因庫中關于大鼠TNF-α、IL-6和β-actin的mRNA序列設計引物。

2.6統計學處理結果以±s表示，應用SPSS13.0統計軟件分析，組間比較用單因素方差(one-way ANOVA)結合LSD檢驗。

3 結果

3.1MTS檢測金釵石斛生物總堿對LPS誘導大鼠皮質星形膠質細胞增生的影響模型組激活的細胞增殖率明顯高于正常組，石斛生物總堿各劑量組與模型組比較明顯降低細胞增殖率(Tab 1)。

3.2金釵石斛生物總堿對LPS誘導的TNF-α蛋白水平的影響模型組激活的細胞TNF-α蛋白表達上升，明顯高于正常組，石斛生物總堿各劑量組與模型組比較均下調TNF-α蛋白的表達(Tab 2)。

Tab 1 Effects of Dendrobium nobile total alkaloids on the astrocyte proliferation induced by LPS(±s，n=8)

Tab 1 Effects of Dendrobium nobile total alkaloids on the astrocyte proliferation induced by LPS(±s，n=8)

#P ＜0.05 vs control group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group

＊＊

Tab 2 Effects of Dendrobium nobile total alkaloids on the level of TNF-α protein induced by LPS(±s，n=5)

Tab 2 Effects of Dendrobium nobile total alkaloids on the level of TNF-α protein induced by LPS(±s，n=5)

#P＜0.05 vs normal group;*P＜0.05 vs model group

Group TNF-α/PG/ml Normal 65.312 ±10.308 Model 98.848 ±10.792#Dendrobium nobile alkaloids(0.025 mg·L －1)81.681 ±9.255*Dendrobium nobile alkaloids(0.25 mg·L －1)80.084 ±8.587*Dendrobium nobile alkaloids(2.5 mg·L －1)75.293 ±10.703*

3.3金釵石斛生物總堿對LPS誘導的星形膠質細胞TNF-α，IL-6 mRNA表達的影響模型組激活的星形膠質細胞TNF-α，IL-6 mRNA表達上升，明顯高于正常組，石斛生物總堿各劑量組與模型組比較其TNF-α，IL-6 mRNA的表達明顯降低(Tab 3)。

Tab 3 Effects of Dendrobium nobile total alkaloids on LPS-induced mRNA expressions of TNF-α and IL-6(±s，n=5)

Tab 3 Effects of Dendrobium nobile total alkaloids on LPS-induced mRNA expressions of TNF-α and IL-6(±s，n=5)

#P＜0.05 vs control group;*P＜0.05 vs model group

Group TNF-αIL-6 Normal 5.81 ±6.25 23.32 ±30.64 Model 100.00 ±12.9# 100.00 ±18.72#Dendrobium nobile alkaloids 0.025 mg·L －1 43.79 ±6.25* 32.92 ±15.73*0.25 mg·L －1 9.01 ±3.61* 32.48 ±2.75*2.5 mg·L －1 6.35 ±1.38* 26.94 ±8.28*

4 討論

在中樞神經系統炎癥環境下，星形膠質細胞和小膠質細胞共同承擔著免疫細胞的角色，尤其是星形膠質細胞，在很多腦部疾病中通過產生和釋放有害的促炎癥反應調節因子如NO、IL-6及TNF-α等來啟動和促進炎癥反應進展［6］。目前神經變性疾病的病因及發病機制尚未闡明，缺乏針對性的治療藥物，相應的治療效果不確切，并且許多藥物長期使用后造成的毒副作用限制了其臨床應用。因此，尋找有效防治神經變性疾病的藥物無疑將為提高人類的生活質量作出巨大貢獻，利用中草藥有效成分防治神經變性疾病是目前國內外新藥研發的重要方向。

本實驗在體外培養的星形膠質細胞中加入LPS，MTS值明顯增加，與隋海娟［7］研究發現 LPS可增加星形膠質細胞分泌IL-1β、IL-6及TNF-α。炎癥因子TNF-α、IL-6分泌量增加，說明星形膠質細胞被激活。LPS誘導的星形膠質細胞的激活包括形態的改變，數量的增加。星形膠質細胞的數目增加起因于星形膠質細胞前體細胞的增殖和(或)分化。炎癥介質比如TNF-α能夠誘導星形膠質細胞分裂。增生活化的星形膠質細胞對神經元的有益或者有害作用一直存在爭論，在神經變性疾病中，發現增生活化的星形膠質細胞可分泌神經營養因子，如堿性成纖維生長因子、腦源性生長因子、睫狀神經營養因子以及膠質細胞源性生長因子等，說明星形膠質細胞具有神經保護及修復作用。本實驗研究發現LPS作用星形膠質細胞，數量明顯增加，活化的星形膠質細胞對神經元的作用是有益的。

炎癥反應在AD的發病和進展中起著非常重要的作用［8］。脂多糖(LPS)直接作用于星形膠質細胞可引起TNF-α和活性氧族的過量生成，產生炎癥和氧化應激雙重損傷［9］。研究發現，TNF-α能夠誘導星形膠質細胞激活，然后迅速地合成大量的TNF-α和IL-6等炎癥細胞因子，導致免疫炎癥損傷，Munoz-Fernandez等［10］研究發現激活的星形膠質細胞能夠產生一氧化氮細胞毒性物質而導致組織的損傷。抗炎和抗氧化是金釵石斛主要的藥理特性，本研究發現金釵石斛生物總堿能明顯地減少IL-6、TNF-α的mRNA表達，提示石斛總堿可通過抑制炎癥通路對神經細胞發揮保護作用。

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［7］隋海娟，金 英，潘月星，等.吡格列酮對脂多糖誘導的星形膠質細胞炎性細胞因子釋放的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(9):1226～30.

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