原矛頭蝮蛇毒中一個新穎雙鏈纖溶酶的分離純化與性質研究

季仁升，孫黔云，乙 引

(1.貴州師范大學生命科學學院，貴州貴陽 550001;2.貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室，貴州貴陽 550002)

蛇毒中含有大量以蛋白質為主的生物活性物質，主要影響機體的血液循環系統、神經系統和肌肉組織等，開展蛇毒研究對蛇傷防治、相關生命科學研究、新藥研發具有重要的意義和價值［1］。原矛頭蝮蛇(Protobothrops mucrosquamatus)，又稱烙鐵頭蛇(Trimeresurus mucrosquamatus)，屬蝰蛇科原矛頭蝮屬，主要分布在我國的南方地區和臺灣地區，是一種常見劇毒蛇，屬血循毒。其蛇傷臨床表現主要為出血、腫脹、嚴重時流血不止。迄今為止，已經從原矛頭蝮蛇毒中分離純化出數個蛋白，涉及L-氨基酸氧化酶、磷脂酶 A2、凝集素、纖溶酶等［2－4］，但總體上對其研究較少。本文報道了湖南產原矛頭蝮蛇毒中一個新穎絲氨酸蛋白酶的分離純化與相關性質研究。

1 材料與方法

1.1材料原矛頭蝮蛇毒采集于湖南省武陵山區;蛋白分離介質 DEAE Sephadex A-50凝膠、Sephadex G-75凝膠、Sephacrycl S-100凝膠、Heparin HP凝膠、Hitrap Q HP預裝柱、低分子量蛋白質標準Marker、凝膠過濾測定分子量試劑盒、兩性電解質Ampholine(pH 3.5～10)均購自瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司;兔抗綿羊紅細胞抗體(溶血素)、乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸(ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N，N，N'，N'-tetraacetic acid，EGTA)、牛纖維蛋白原、苯甲酰-L-精氨酸乙酯(Nα-Benzoyl-L-arginine ethyl ester hydrochloride，BAEE)、偶氮酪蛋白(azocasein)、十二烷基硫酸鈉(SDS)購自美國Sigma公司;增強型BCA蛋白定量試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所;綿羊紅細胞采自貴陽醫學院實驗動物中心，混合人血清由本實驗室健康志愿者獻血制備而得;昆明種小鼠購自第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心，合格證號:SCXK(渝)2007-0005;其它試劑均為進口或國產分析純。

1.2儀器AKTA Prime蛋白層析系統、Gene Quant紫外分光光度計(瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司);Spectra MAX-190連續波長酶標儀(美國MD公司);5810R冷凍離心機(德國Eppendorf公司);FDU-1100冷凍干燥機 (日本東京理化器械株式會社);DYY-8C電泳儀、DYCZ-24D電泳槽(北京市六一儀器廠)。

1.3方法

1.3.1目標蛋白的分離純化1.0 g原矛頭蝮蛇粗毒凍干粉溶于7 ml的50 mmol·L－1pH 8.9 Tris-HCl緩沖液中，離心后取上清上樣于DEAE Sephadex A-50陰離子交換柱(2.6 cm×90 cm)，充分洗脫后用0 ～0.4 mol·L－1NaCl(1 000 ml∶1 000 ml)線性洗脫，流速為 24 ml·h－1，每管收集 6 ml，檢測纖維蛋白原水解活性，收集相關活性峰，凍干后溶于PBS緩沖液，上樣于Sephadex G-75凝膠(1.6 cm×75 cm)，流速為 15 ml·h－1，每管 3 ml，收集活性峰濃縮，脫鹽，上樣于肝素親和柱(1.0 cm×15 cm)，在AKTA Primer上進行分離純化，流速為2 ml·min－1，收集活性峰，再采用 HiTrap Q HP 1 ml預裝柱分離純化，流速為1 ml·min－1，收集活性峰，12%SDS-PAGE測定純度。

1.3.2分子量和等電點的測定12%SDS-PAGE測定目標蛋白在還原與非還原條件下的分子量。凝膠過濾測定分子量采用Sephacrycl S-100凝膠(1.0 cm×60 cm)，按照試劑盒說明書進行。變性條件下目標蛋白的等電點測定同文獻［5］。

1.3.3蛋白水解活性檢測

1.3.3.1纖維蛋白原水解活性測定 參照文獻［5］的方法加以改動。200 μl質量分數為0.2% 纖維蛋白原液(400 μg，50 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.5，0.15 mol·L－1NaCl配制)加入 100 μl PMSP-A(含20 μg)于 37℃水浴孵育 1/6、1/2、1、2、3、6、9、12 和24 h后，12%SDS-PAGE檢測。

1.3.3.2纖維蛋白水解活性測定 參照文獻［5］的方法加以改動，取90 mm直徑平皿加入9 ml質量分數為0.5%牛纖維蛋白原，再加入300 μl 20 kU·g－1的人凝血酶，混勻后室溫放置2 h，然后加入20 μl PMSP-A(含20 μg)，37℃孵育 24 h 后，觀察測量水解圈。原矛頭蝮蛇粗毒為陽性對照。

1.3.3.3精氨酸酯酶活性測定 參考文獻［5］的方法:BAEE 作為底物，100 μl PMSP-A(含 100 μg)加入 3 ml BAEE(1 mol·L－1，67 mmol·L－1，pH 7.0的PB配制)，于37℃水浴孵育6 h后，253 nm測定吸光度，將每分鐘吸光度上升0.001定義為1個活力單位，原矛頭蝮蛇蛇粗毒為陽性對照。

1.3.3.4偶氮酪蛋白水解活性 測定參照文獻［5］的方法:100 μl PMSP-A(含100 μg)加入1 ml azocasein(5 g·L－1，60 mmol·L－1NaHCO3配制)于37℃水浴孵育6 h后，加入1 ml 1.16 mol·L－1高氯酸終止反應，溶液過濾后于390 nm測定吸光度。原矛頭蝮蛇粗毒為對照。

1.3.4酶抑制劑對纖維蛋白原水解活性的影響測定參照文獻［5］的方法:100 μl PMSP-A(含 4 μg)分別與 PMSF(10 mmol·L－1)、EDTA(10 mmol·L－1)、1，10-phenanthroline(10 mmol·L－1)、SBTI(0.5 g·L－1)、EGTA(50 mmol·L－1)在 37 ℃孵育30 min后加入20 μl(含40 μg)牛纖維蛋白原孵育24 h，10%SDS-PAGE檢測纖維蛋白原水解活性。

1.3.5抗補體活性測定抗補體活性經典途徑測定參考文獻［6］方法。樣品、人血清(1∶17.5稀釋)各100 μl混勻，37℃水浴預孵30 min或不預孵，然后加入100 μl致敏綿羊紅細胞(5 ×1011cells·L－1)混勻，37℃孵育30 min后再加入1 ml冷生理鹽水終止反應，2 000 r·min－1離心10 min，取上清液于412 nm測定吸光度。

1.3.6出血毒活性檢測參照文獻［7］的方法加以改動。♀昆明種小鼠(體質量20～30 g，n=6)背部皮下注射 2.5 μg·g－1PMSP-A，24 h 后皮膚內側檢測出血情況，原矛頭蝮蛇粗毒為陽性對照。

1.3.7水腫活性檢測參照文獻［8］的方法加以改動。昆明種小鼠(體質量20～30 g，n=6)隨機分組，每組♀♂各半，左、右后足分別注射15 μl PMSPA(含5 μg)與PBS緩沖液，2.5 h后處死，在相同位置剪下左、右后足，稱重后計算腫脹率:

1.3.8流血時間測定參照文獻［4］的方法加以改動，昆明種小鼠(體質量20～30 g，n=6)隨機分組，每組♀♂各半，以0.5 μg·g－1的劑量尾部靜脈注射目標蛋白，正常對照組注射同等體積的PBS緩沖液，注射30 min后，距尾部末端1.0 cm處切深度1～2 mm的傷口，血液自行流出開始計時，每30 s用濾紙吸去血滴，直至流血停止(以濾紙吸取時無血流出作為流血停止標志)。

1.3.9肽指紋圖譜測定純化后的樣品經還原SDS-PAGE電泳后，切取含有蛋白的膠條用胰蛋白酶水解，用4700 proteomics Analyzer(Applied Biosystems，USA)進行肽指紋圖譜測定。激光源為355 nm波長的Nd:YAG激光器，加速電壓為20 kV，采用正離子模式和自動獲取數據的模式采集數據。PMF質量掃描范圍為700～4 000 u，且強度最大的10個峰進行串級質譜分析;譜圖用myoglobin酶解肽段進行外標校正。所得結果用GPS(Applied Biosystems，USA)–MASCOT(Matrix Science，London，UK)進行數據庫檢索。搜索參數設置:數據庫為NCBInr;數據檢索的方式為combined;最大允許漏切位點為1;質量誤差范圍設置:PMF±100 ppm，MS/MS±0.6 u。

1.3.10統計學分析本實驗數據采用±s表示，采用SPSS 16.0以t檢驗進行統計學分析。采用GraphPad Prism 3進行作圖分析。

2 結果

Fig 1 Purification of PMSP-A

2.1PMSP-A的分離純化原矛頭蝮蛇毒經DEAE Sephadex A-50陰離子交換層析后取第340～356管(Fig 1A)收集合并上樣于Sephadex G-75凝膠層析柱，取洗脫峰2(21～36管)(Fig 1B)，再經Heparin HP親和層析純化，取洗脫得到第一個蛋白峰(Fig 1C)，最后經HiTrap Q HP陰離子交換層析得到的目標蛋白(Fig 1D)，命名為PMSP-A，SDS-PAGE檢測為一條帶。

2.2分子量與等電點經12%SDS-PAGE檢測，PMSP-A在非還原條件下分子量為26.1 ku，還原狀態下呈現分子量分別是15.1 ku與14.4 ku的兩條多肽鏈(Fig 2A)。經Sephacryl S-100凝膠過濾測定，PMSP-A分子量為25.3 ku(Fig 3)。通過等電聚焦電泳測定PMSP-A的兩條肽鏈的等電點分別為5.7與6.1(Fig 2B)。

Tab 1 Theoretical and experimental peptide masses of PMSP-A

Fig 2 Electrophoresis of PMSP-A

2.3蛋白水解活性及抑制劑對蛋白質水解酶活性的影響

2.3.1纖維蛋白原水解活性PMSP-A能夠依次水解纖維蛋白原的Bβ鏈，Aα鏈，孵育24 h內沒有檢測到水解γ鏈(Fig 4)。

2.3.2抑制劑對纖維蛋白原水解活性影響PMSP-A的纖維蛋白原水解活性受PMSF、1，10-phenan-throline的抑制，EDTA、EGTA、SBTI不能抑制其水解活性(Fig 5)。

Fig 3 Molecular weight determination of PMSP-A by gel filtration on a Sephacryl S-100 column

Fig 4 Fibrinogenolytic activity of PMSP-A

Fig 5 Effect of inhibitors on the fibrinogenolytic activity of PMSP-A

2.3.3纖維蛋白水解活性PMSP-A對纖維蛋白具有水解活性(Fig 6)。

Fig 6 Fibrinolytic activity of PMSP-A

2.3.4其他蛋白水解活性測定PMSP-A的精氨酸酯酶活力單位為8.7 kU·g－1，它沒有偶氮酪蛋白水解活性。

2.4肽指紋圖譜分析肽指紋圖譜測定PMSP-A與黃綠烙鐵頭蛇毒中C-型凝集素二聚體中鏈A的部分肽段吻合。

2.5抗補體活性預孵條件下終濃度為0.075 g·L－1的PMSP-A對補體經典途徑溶血有(55.59±5.22)% 的抑制率，在不預孵條件下只有微弱的抑制活性(4.66±1.50)%。

2.6出血活性以2.5 μg·g－1劑量的 PMSP-A注射到小鼠皮下，24 h后未見出血斑點。

2.7水腫活性5 μg PMSP-A注射到小鼠足趾，2 h后引起的腫脹率為(14.55±3.13)%，見Fig 7。

Fig 7 Effect of PMSP-A on inducing edema of mice paw

2.8對流血時間的影響0.5 μg·g－1劑量的PM-SP-A注射到小鼠尾靜脈，與PBS對照組(502.20±172.25)s相比，PMSP-A能夠明顯延長小鼠尾靜脈的流血時間(803.57±224.28)s。

3 討論

本研究從湖南產原矛頭蝮蛇毒中分離純化得到一個具有纖溶活性的酸性蛋白酶PMSP-A，其由兩條非均等的肽鏈共價鍵組成，分子量(25～26)ku。它能夠依次水解纖維蛋白原的Bβ、Aα鏈，活性能夠被PMSF抑制，EDTA、EGTA不能抑制其活性，且具有精氨酸酯酶活性，提示PMSP-A為絲氨酸蛋白酶。PMSP-A對纖維蛋白也具有水解活性，同時它能抑制補體經典途徑溶血，PMSP-A能明顯延長小鼠尾靜脈的流血時間，引起小鼠足趾水腫，無出血毒活性。

非還原SDS-PAGE和凝膠過濾檢測PMSP-A為單一蛋白，還原SDS-PAGE則表現為兩條非均等的多肽鏈，表明PMSP-A是由兩條非均等肽鏈共價組成。這種肽鏈的不均等可能是由于蛋白質后期修飾造成的差異，也可能是兩條不同的肽鏈。迄今為止，只在我國臺灣地區產原矛頭蝮蛇毒中發現過兩個雙鏈結構的蛋白，其中一個是具有血小板凝集活性但無纖維蛋白原水解活性的雙鏈蛇毒蛋白［9］，另外一個是也具有血小板凝集活性的C-型凝集素［3］。因此，可以認為PMSP-A是首次從原矛頭蝮蛇毒中發現的雙鏈絲氨酸蛋白酶。

蛇毒絲氨酸蛋白酶具有纖維蛋白(原)水解活性，在血管疾病治療方面有著廣泛的價值，目前已有數種蛇毒絲氨酸蛋白酶制劑如 Ancrod、Batroxobin等在臨床應用［10－11］。本工作中的 PMSP-A具有纖維蛋白(原)水解活性，能明顯延長小鼠尾靜脈的流血時間，提示它具有抗凝活性。PMSP-A抗凝的作用是否只與其水解纖維蛋白(原)有關，以及其影響血液凝固的機制尚待進一步的研究。

通過肽指紋圖譜分析，PMSP-A的部分肽段與黃綠烙鐵頭(Trimeramaturus flavoviridis)蛇毒中一個具有抗凝活性的C型凝集素中異源二聚體中的鏈A部分序列吻合［12－13］。本實驗純化得到的 PMSP-A也能延長小鼠尾靜脈流血時間，提示目標蛋白結構與功能間的內在聯系。開展PMSP-A的結構研究將有助于加深對蛇毒絲氨酸蛋白酶結構與功能關系的理解和認識。

補體系統是機體免疫防御的第一道防線，具有重要的免疫調節作用。從蛇毒中已分離純化出一些具有抗補體作用的蛋白酶，這些蛋白酶主要是通過酶切的方式作用于補體，例如從黃綠烙鐵頭蛇毒中分離出的絲氨酸蛋白酶flavoxobin［14］，它具有C3/C5轉化酶活性，能酶切補體C3、C5，生成生理活性片段。本課題組從原矛頭蝮蛇毒中純化得到了一個具有抗補體活性的金屬蛋白酶TMAC-1，它能夠裂解補體C3和C5，但酶切產物不能激活內皮細胞釋放P-selectin［15］。PMSP-A在預孵條件下能明顯抑制補體經典途徑溶血，但不預孵條件下幾乎不能抑制補體經典途徑溶血，表明PMSP-A是通過酶切方式作用于補體系統。補體系統和血液系統中起關鍵作用的酶都是絲氨酸蛋白酶。PMSP-A是蛇毒絲氨酸蛋白酶，它既能作用于補體，又能影響血液的正常凝集，其酶切補體只是偶然的底物適配或是具有特殊的生物學功能和意義，值得進一步研究探討。

本工作從湖南產原矛頭蝮蛇毒中分離純化出一個新穎的雙鏈絲氨酸蛋白酶PMSP-A，它具有纖維蛋白(原)水解活性，能明顯延長小鼠尾靜脈流血時間，同時它也具有抗補體活性。本研究將能加深對原矛頭蝮蛇毒蛇傷的認識和理解，能為其蛇傷防治提供有益的思路和參考，同時，PMSP-A對血液系統的作用和潛在應用值得進一步研究評價。

［1］涂光儔，冉永祿.近年來蛇毒酶研究的進展［M］//陳遠聰，李文杰，主編.中國生物化學會專題討論會文集(2):蛇毒的生化、毒理和應用.北京:科學出版社，1983:1－8.

［1］Tu G C，Ran Y L.Research progress of snake venom enzymes in recent years［M］//Chen Y C，Li W J，chief ed.Symposium anthology of the Chinese society of biochemistry(2):Biochemistry，toxicology and application of snake venom.Beijing:Science Press，1983:1－8.

［2］Wei J F，Wei Q，Lu Q M，et al.Purification，characterization and biological activity of an L-amino acid oxidase from Trimeresurus mucrosquamatus venom［J］.Acta Bichim et Biophys Sin，2003，35(3):219－24.

［3］Chen Y S，Huang C H，Chiou S H.Characterization and molecular cloning of one novel C-type lectin from the venom of Taiwan habu(Trimeresurus mucrosquamatus)［J］.Toxicon，2010，55(4):762－72.

［4］Hung C C，Chiou S H.Fibrinogenolytic proteases isolated from the snake venom of Taiwan Habu:serine proteases with kallikrein-like and angiotensin-degrading activities［J］.Biochem Biophys Res Commun，2001，281(4):1012－18

［5］Sun Q Y，Li M，Yang F M.Purification and characterization of a metalloproteinase with weak fibrinogenolytic activity from Naja atra venom［J］.Chin J Biochem Mol Biol，2007，23(10):835 －43.

［6］Sun Q Y，Bao J.Purification，cloning and characterization of a metalloproteinase from Naja atra venom［J］.Toxicon，2010，56(8):1459－69.

［7］Ownby C L，Bjarnason J，Tu A T.Hemorrhagic toxins from rattlesnake(Crotalus atrox)venom.Pathogenesis of hemorrhage induced by three purified toxins［J］.Am J Pathol，1978，93(1):201－18.

［8］Gutiérrez J M，Romero M，Díaz C，et al.Isolation and characterization of a metalloproteinase with weak hemorrhagic activity from the venom of the snake Bothrops asper(terciopelo)［J］.Toxicon，1995，33(1):19－29.

［9］Chiou S H，Huang K F，Chow L P，et al.Isolation of a venom factor devoid of proteolytic activity from Taiwan Habu(Trimeresurus mucrosquamatus):N-Terminal sequence homology and no functional similarity to factors IX/X-Binding proteins and botrocetin［J］.J Protein Chem，1996，15(7):667 －74.

［10］Swenson S，Markland F S Jr.Snake venom fibrin(ogen)olytic enzymes［J］.Toxicon，2005，45(8):1021 －39.

［11］Matsui T，Fujimura Y，Titani K.Snake venom proteases affecting hemostasis and thrombosis［J］.Biochim Biophys Acta，2000，1477(1-2):146－56.

［12］Atoda H，Morita T.A novel blood coagulation factorⅨ/factorⅩ-binding protein with anticoagulant activity from the venom of Trimeresurus flavoviridis(habu snake):Isolation and characterization［J］.J Biochem，1989，106(5):808－13.

［13］Atoda H，Ishikawa M，Yoshihara E，et al.Blood coagulation factorⅨ-binding protein from the venom of Trimeresurus flavoviridis:Purification and characterization［J］.J Biochem，1995，118(5):965－73.

［14］Yamamoto C，Tsuru D，Oda-Usda N，et al.Flavoxobin，a serine protease from Trimeresurus flavoviridis(habu snake)venom，independently cleaves Arg726-Ser727 of human C3 and acts a novel，hererologous C3 convertase［J］.Immunology，2002，107(1):111－7.

［15］閆銀萍，孫黔云.烙鐵頭蛇毒中一個抗補體活性金屬蛋白酶的純化和性質研究［J］.中國藥理學通報，2010，26(9):1220－25.

［15］Yan Y P，Sun Q Y.Purification and characterization of a metalloproteases with anti-complementary activity from Trimeresurus mucrosquamatus Venom［J］.Chin Pharrmacol Bull，2010，26(9):1220－5.