HBx蛋白對α干擾素誘導(dǎo)的MxA蛋白表達的影響

管世鶴，潘 穎，楊 凱，沈繼龍，楊東亮

(安徽醫(yī)科大學(xué)1.第二附屬醫(yī)院檢驗科，2.人獸共患病安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230032;3.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院臨床免疫研究室，湖北武漢 430030)

HBx蛋白(Hepatitis B virus X protein)是HBV X基因編碼的多功能蛋白，不僅能夠影響細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑如:ERK、SAPK-JNK、p38、Ras-Raf-MAP、PI-3-K途徑等［1－2］，還在病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制、肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展等過程起到重要作用［3－4］。有研究報道［5］，激活的ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能會影響 α干擾素(IFN-α)誘導(dǎo)的JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分子的表達，但HBx蛋白能否通過ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑抑制IFN-α抗病毒活性目前尚不清楚。為此，本研究以HepG2細(xì)胞為研究模型，通過基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)分析HBx蛋白能否影響IFN-α抗病毒蛋白表達，并通過ERK抑制劑PD98059抑制ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進一步探討HBx蛋白可能存在拮抗IFN-α抗病毒活性的分子生物學(xué)機制。

1 材料和方法

1.1主要材料轉(zhuǎn)染試劑盒脂質(zhì)體LipofectamineTM2000與RNA提取試劑盒Trizol Reagent購自Invitrogen公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse Transcription System購自Promega公司。RT-PCR引物由上海生物工程有限公司合成。IFN-α1b購自深圳科興生物工程有限公司。兔抗人抗-磷酸化ERK，兔抗人抗-STAT1抗體、兔抗人抗-磷酸化STAT1抗體購自Bioworlde公司。二抗購自中杉金橋公司。PD98059購自Promega公司，質(zhì)粒pcDNA3.1(-)購自Invitrogen公司。重組質(zhì)粒FL1-145HBx由美國Drexel大學(xué)醫(yī)學(xué)院Dr.Clippinger惠贈，HepG2細(xì)胞由本實驗室保存。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理HepG2細(xì)胞用含10%小牛血清、1×105U·L－1青霉素、1×105U·L－1鏈霉素、2 mmol·L－1谷氨酰胺 DMEM 培養(yǎng)液培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天行HepG2細(xì)胞傳代，并以5×107·L－1接種6孔板。接種后2 d待細(xì)胞匯合約為75%時，按試劑盒說明書步驟分別混合質(zhì)粒pcDNA3.1(-)或 FL1-145HBx 4μg與 LipofectamineTM2000 250 μl至無血清DMEM行轉(zhuǎn)染。HepG2細(xì)胞分為4組，對照組(CG):HepG2細(xì)胞不做任何處理;空載體組(EG):HepG2細(xì)胞按上述轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1(-);轉(zhuǎn)染組(TG):HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達HBx蛋白的質(zhì)粒FL1-145HBx;預(yù)處理組(PG):HepG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 FL1-145HBx后 6 h換含有 40μmol·L－1的PD98059的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。以1 000 kU·L－1的IFN-α作用于各組細(xì)胞6 h。

1.3免疫印跡法檢測蛋白表達預(yù)冷PBS洗6孔板中細(xì)胞3次，每孔加80 μl含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上反應(yīng)10 min，振蕩，12 000 r·min－14℃離心 10 min，收集上清液與 20 μl蛋白上樣緩沖液混合煮沸10 min。取20 μl行SDS-PAGE電泳，80mA電流2 h濕電轉(zhuǎn)，10%脫脂奶粉封閉過夜，加一抗過夜，PBS洗3次，加二抗室溫孵育2 h，PBS漂洗3次，ECL試劑盒檢測。

1.4 RT-PCR檢測MxA、STAT1細(xì)胞總RNA的提取采用 TRIzol試劑，并參照文獻［6］進行 RT-PCR操作。以目的基因與內(nèi)參β-actin灰度值的比值表示目的基因mRNA相對表達水平。(引物序列及反應(yīng)條件見Tab 1)。

Tab 1 Primers and reaction conditions

1.5統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)用±s表示。用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，組間采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1HBx蛋白對IFN-α誘導(dǎo)的MxA蛋白表達的影響以1 000 kU·L－1濃度的IFN-α處理各組細(xì)胞，免疫印跡和RT-PCR法分別檢測細(xì)胞HBx蛋白和MxA mRNA表達水平。從Fig 1和Fig 2可以看出，轉(zhuǎn)染組和預(yù)處理組細(xì)胞均能夠表達HBx蛋白，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞MxA mRNA表達水平(0.32±0.03)明顯低于對照組(0.65±0.05)和空載體組(0.66±0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=59.39，P＜0.05)。而經(jīng)PD98059預(yù)處理的細(xì)胞中，MxA mRNA表達水平(0.59±0.05)接近于對照組和空載體組(F=1.91，P＞0.05)。

Fig 1 Expression of HBx protein in each group

Fig 2 Effects of HBx on the expression of MxA mRNA in each group

2.2HBx蛋白對IFN-αJAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分子STAT1表達的影響RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞STAT1 mRNA表達水平為(0.47±0.06)，與對照組(2.13±0.12)和空載體組(2.15±0.09)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=325.92，P＜0.05)(見Fig 3)。免疫印跡檢測結(jié)果與RT-PCR檢測結(jié)果相符合，即轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中t-STAT1及p-STAT1明顯低于對照組和空載體組(見Fig 4、Tab 2)。

Tab 2 Expression of p-STAT1 and t-STAT1 protein in each group(±s，n=8)

Tab 2 Expression of p-STAT1 and t-STAT1 protein in each group(±s，n=8)

*P ＜0.05 vs untransfected group and empty vector group.

Group p-STAT1 protein t-STAT1 protein Control group 2.63 ±0.38 2.64 ±0.33 Empty vector group 2.40 ±0.45 2.48 ±0.06 Transfection group 0.51 ±0.04* 0.58 ±0.03*Pre-treatment group 1.77 ±0.12 2.33 ±0.14

Fig 3 Effects of HBx on the expression of STAT1 mRNA in each group

Fig 4 Effects of HBx on the expression of p-STAT1 and t-STAT1 protein in each group

2.3HBx蛋白對ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響為進一步研究HBx蛋白抑制MxA蛋白表達的機制，免疫印跡法檢測各組細(xì)胞中p-ERK蛋白表達情況。從Fig 5可以看出，隨著HBx蛋白的表達，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中 p-ERK蛋白表達增強，但經(jīng) ERK抑制劑PD98059預(yù)處理后，細(xì)胞中p-ERK蛋白的表達明顯降低。

Fig 5 Effects of HBx on the expression of p-ERK protein in each group

3 討論

IFN-α是臨床治療乙型肝炎的重要藥物之一，它通過與細(xì)胞膜上的的受體結(jié)合誘導(dǎo)胞質(zhì)中的STAT蛋白P91和P113進行酪氨酸磷酸化，最終促發(fā)和誘導(dǎo)細(xì)胞表達多種抗病毒蛋白:如雙鏈RNA激活的蛋白激酶(PKR)、2'，5'-寡腺苷酸合成酶(2'，5'-OAS)、抗黏液病毒A蛋白(MxA)、抗粘液病毒B蛋白(MxB)［7－8］。然而，本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，在體外IFN-α并不能抑制HepG2.2.15細(xì)胞中HBV的復(fù)制，進一步的研究發(fā)現(xiàn)［9］，IFN-α誘導(dǎo)的重要的抗病毒蛋白MxA蛋白在HepG2.2.15中不表達，在HepG2細(xì)胞中能夠正常表達。據(jù)此，我們推測HBV可能通過抑制MxA蛋白的表達而發(fā)揮拮抗干擾素的抗病毒作用。

HBx是一種具有雙重作用的轉(zhuǎn)錄激活因子，具有促進多種蛋白激酶的活化，并激活體內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的功能，其與ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相互作用在乙型肝炎的發(fā)病和發(fā)展中起著重要作用［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，在表達HBx蛋白的 HepG2細(xì)胞中，IFN-α誘導(dǎo)的抗病毒蛋白MxA表達降低，同時JAKSTAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分子p-STAT1和t-STAT1的表達也下降，這表明HBx蛋白很可能通過影響STAT1蛋白的表達及磷酸化而抑制抗病毒蛋白MxA的表達，進而拮抗IFN-α抗病毒活性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，特異性的ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑阻斷劑PD98059能夠通過抑制p-ERK蛋白的表達而恢復(fù)抗病毒蛋白MxA和JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑分子p-STAT1和t-STAT1的表達。上述研究結(jié)果表明HBx蛋白很可能通過ERK信號途徑與JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的共同作用，從而影響IFN-α抗病毒蛋白MxA的表達。

本研究初步探討HBx蛋白對IFN-α誘導(dǎo)抗病毒活性可能存在的影響，并推測HBx蛋白很可能通過抑制抗病毒蛋白的表達而發(fā)揮拮抗和反作用IFN-α抗病毒作用，這也很可能是部分乙型肝炎患者干擾素治療效果不佳的原因之一。

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