白花丹素致體外培養肝細胞的損傷及改構型酸性成纖維細胞生長因子對肝細胞的保護作用

徐雅玲，黃巨恩，劉華鋼

(廣西醫科大學護理學院，廣西南寧 530021)

中藥是我國的傳統醫藥，有著數千年的應用歷史，許多傳統中藥存在抗癌有效成分，其中有相當一部分己應用于臨床，成為腫瘤綜合治療方案中的重要內容。但隨著中草藥及其制劑在世界范圍的廣泛應用，中藥毒副反應的問題受到廣泛的關注。白花丹素是具有廣西特色的、性辛、味苦、有小毒的中藥，它對4種腫瘤細胞系Raji、Calu-1、HeLa和Wish都表現出了較強的細胞毒活性，能明顯抑制這些腫瘤細胞的生長［1］。但由于其自身的細胞毒作用，會對正常器官產生毒副作用。韋敏等［2］研究已證實了白花丹素可抑制人胚腎細胞293的增殖，對腎臟有一定的毒性。但白花丹素體內外肝毒性的研究迄今尚未見文獻報道。因此，考察這一類是否具有細胞毒作用的抗腫瘤中藥活性成分一直是臨床工作者研究的方向，同時，如何改善和治療這種損傷也是人們關注的熱點。

探索各種細胞因子對組織、器官損傷的防治目前已越來越受到人們的關注。aFGF作為一種抗損傷、促進創傷愈合，并具有神經營養作用的因子引起了人們重視。黃巨恩等［3］研究表明aFGF對由慶大霉素引起的體外培養的大鼠腎小管上皮細胞損傷有保護作用。但是，由于野生型aFGF的促分裂活性與細胞增殖、分化以及腫瘤發生存在一定的聯系，因而在大規模應用時受到一定的限制。為此，通過基因工程技術，將野生型aFGF進行了改構，得到一種改構體aFGF，該改構體aFGF失去了促分裂效應，保留其非促分裂激素樣活性［4］。但改構型酸性成纖維細胞生長因子(MaFGF)是否對白花丹素所造成肝細胞的損傷具有保護作用，以及機制如何，尚未見文獻報道。

動物肝損傷模型種類很多，包括化學性肝損傷、藥物性肝損傷、酒精性肝損傷、免疫性肝損傷等［5－6］。本研究建立白花丹素致原代培養的大鼠肝細胞損傷的模型:觀察MaFGF對損傷肝細胞的作用，并從細胞水平上初步探討白花丹素的毒性與MaFGF的保護作用機制，為其進一步的開發利用提供實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物和試劑Wistar大鼠4只，體質量(8±2)g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。DMEM-HG、胎牛血清、胰蛋白酶、膠原酶由Gibco公司提供。基因重組人酸性成纖維細胞生長因子(rhaFGF)由暨南大學生物工程研究所提供(批號20050618)。一氧化氮(NO)、乳酸脫氫酶(LDH)、谷氨酸丙酮酸轉氨酶(GPT)、谷氨酸草酰乙酸轉氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)以及丙二醛(MDA)的測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2方法

1.2.1肝組織的分離、消化斷頭處死大鼠，無菌條件下取肝臟，用PBS平衡鹽溶液清洗幾次，剝離肝被膜，將其剪成 1 mm3大小的組織塊，加入0.25%胰酶消化 3 min，用含 10%胎牛血清的DMEM-HG終止消化，以800 r·min－1離心5 min，棄上清;0.1%膠原酶消化10min，加入培養基洗滌，充分吹打2 min使組織膨松絮狀，靜置5 min，取中下2/3的上清于另一離心管中收集細胞懸液，以1 000 r·min－1離心5 min ，棄上清液，洗滌 2 次，所得沉淀即為分離的肝細胞。

1.2.2肝細胞的培養加入5 ml含10%胎牛血清的DMEM-HG培養液，充分吹打直到其分散為細胞懸液為止。臺盼藍活細胞計數＞85%，調整細胞濃度以5 ×105·L－1接種于培養瓶內 37℃、5%CO2、飽和濕度靜置培養。細胞72～120 h處于對數生長期，可用于實驗。

1.2.3細胞的藥物處理與細胞毒檢測分組實驗分5組(n=5):①對照組:即在含10%FBS的DMEM-HG培養液中繼續培養48 h的細胞。對照組設6個復孔。②白花丹素組:前24 h培養條件與對照組無異，24 h 后在含 10、20、30、40、50 μg·L－1白花丹素的培養基中繼續培養24 h。③ MaFGF低濃度組(Ⅰ組):上述濃度的白花丹素處理24 h后，加入終濃度為3.12×10－3mg·L－1的 MaFGF繼續培養24 h。④MaFGF中濃度組(Ⅱ組):上述濃度的白花丹素處理24 h后，加入終濃度為4.68×10－3mg·L－1的MaFGF繼續培養24 h。⑤ MaFGF高濃度組(Ⅲ組):上述濃度的白花丹素處理24 h后，加入終濃度為7.80×10－3mg·L－1的 MaFGF繼續培養24 h。以上各組均取原代培養d 3的細胞。給藥48 h后加入MTT試劑檢測其OD值。

1.2.4細胞因子對肝細胞保護作用的實驗分組實驗分3組(n=5):①對照組(未加處理因素):即在含10%胎牛血清的DMEM-HG培養液中培養48 h的細胞;② 致傷組(白花丹素組):前24 h培養條件與對照組無異，24 h后即暴露在含20 μg·L－1白花丹素的10%胎牛血清的DMEM-HG培養液中培養24 h的細胞;③細胞因子組(白花丹素+MaFGF組):即在加入含20 μg·L－1白花丹素和10%胎牛血清的DMEM-HG培養液中培養24 h后再加7.80×10－3mg·L－1MaFGF繼續培養24 h的細胞。以上各組均取原代培養d 3的細胞，給藥48 h后檢測細胞生化和酶學指標。

1.3統計學分析本實驗的數據結果以±s表示，運用SPSS13.0軟件進行統計分析，多組樣本間均值比較采用單因素方差分析，兩組樣本間均值比較采用獨立樣本t檢驗。

2 結果

Fig 1 Hepatocytes show good growth after 96h(200 × )Fig 2 Hepatocytes show distension 24 h after plumbagin(20 μg·L-1)was added(200 × )Fig 3 Hepatocytes injured by plumbagin(20 μg·L-1)24 h and protected by MaFGF(7.80 ×10-3mg·L-1)24 h(200 × )

2.1加藥培養48 h后細胞形態的改變正常分離培養的肝細胞呈鋪路石樣，體積較大，鏡下透明度及折光性強，各細胞緊密相靠，互相銜接，可融合成片或復層生長。(1)＞=20 μg·L－1的白花丹素作用24 h:①細胞明顯腫脹、邊界消失;② 原有的鋪路石樣變圓皺縮;③ 多個細胞融合成團塊狀，細胞密度下降;④ 部分細胞胞質內黑色顆粒和空泡增多，呈老化狀;⑤培養液中多見細胞碎片;(2)白花丹素+MaFGF作用24 h:①細胞輪廓較清晰，邊界折光性尚好;② 細胞變圓，皺縮程度減輕;③ 細胞胞質較豐富，立體感較強，胞質內少見黑色顆粒和空泡;④培養液中細胞碎片較少。

2.2MTT法檢測白花丹素對體外肝細胞生長的抑制效果不同濃度的白花丹素處理24 h，檢測其對肝細胞生長的影響。經過方差分析統計學處理可以得知:5組濃度之間抑制率比較，P=0.000，P＜0.05，具有統計學意義;其中 10 μg·L－1與 20 μg·L－1抑制率比較，P=0.359，P＞0.05，不具有統計學意義，其他濃度與 10 μg·L－1抑制率比較，P=0.000，均小于0.05，具有統計學意義。說明白花丹素對肝細胞具有抑制作用，且不同濃度的白花丹素之間的抑制率存在差異。從MTT的結果可以得出，白花丹素對肝細胞的抑制率隨著藥物濃度的增加而增加。不同濃度白花丹素的抑制率見Tab 1。

Tab 1 Inhibition rate of plumbagin and plumbagin+MaFGF on hepatocytes(%，±s)

Tab 1 Inhibition rate of plumbagin and plumbagin+MaFGF on hepatocytes(%，±s)

*P ＜0.05 vs 10 μg·L －1plumbagin;#P ＜0.05 vs plumbagin group

Concentration/μg·L－1 Plumbagin Plumbagin+MaFGFⅠPlumbagin+MaFGFⅡPlumbagin+MaFGF Ⅲ10 48.26 ±5.09 38.97 ±1.74# 30.56 ±2.47# 21.39 ±3.57#20 51.07 ±2.61 41.85 ±4.00# 33.00 ±3.20# 25.44 ±3.90#30 72.50 ±2.27* 60.26 ±1.68*# 43.30 ±3.30*# 30.52 ±0.36*#40 81.07 ±1.65* 71.85 ±0.51*# 58.93 ±1.09*# 37.28 ±1.24*#50 91.92 ±2.71* 82.47 ±2.91*# 64.81 ±4.72*# 48.43 ±2.03*#

2.3MaFGF對白花丹素體外肝毒性的保護作用

4.68 ×10－3～7.80 ×10－3mg·L－1的 MaFGF 作用24 h后:采用方差分析進行統計學處理，不同濃度的MaFGF對白花丹素的肝細胞毒性的抑制率之間差異有顯著性。4.68×10－3～7.80×10－3mg·L－1的 MaFGF 與白花丹素組比較，P=0.005，P＜0.05，具有統計學意義;4.68 ×10－3mg·L－1的MaFGF組與 6.24 ×10－3mg·L－1的 MaFGF 組比較，P=0.001，P＜0.05，具有統計學意義;6.24×10－3mg·L－1的 MaFGF 組與 7.80 ×10－3mg·L－1的MaFGF組比較，P=0.000，P＜0.05，具有統計學意義;白花丹素作用肝細胞24 h回歸方程為^Y=1.173X+33.768(r=0.959)，利用SPSS軟件計算其IC50=13.603 μg·L－1(IC50即半數抑制濃度，是指一種毒物能將某種細胞活力抑制50%所需的濃度);4.68×10－3mg·L－1的 MaFGF 作用24 h 的回歸方程為^Y=1.17X+23.980(r=0.969)，IC50=18.441 μg·L－1;6.24 ×10－3mg·L－1的 MaFGF 作用24 h的回歸方程為^Y=0.9443X+17.791(r=0.953)，IC50=31.175 μg·L－1;7.80 × 10－3mg·L－1的MaFGF作用24 h的回歸方程為^Y=0.659X+12.836(r=0.958)，IC50=75.373 μg·L－1。

通過“相關分析”和“回歸分析”并結合以上生長抑制直條圖，可得出MaFGF對白花丹素的肝毒性的抑制作用具有比較明顯的劑量－效應特點。(見Fig 4)且隨著MaFGF作用濃度的增大，藥物的IC50值明顯增高，以7.80 ×10－3mg·L－1的 MaFGF 作用24h的增幅最為明顯。見Fig 5。

Fig 4 Inhibitory effects of plumbagin and plumbagin+MaFGF on hepatocytes at 24 h

Fig 5 Median inhibitory concentration of plumbagin and plumbagin+MaFGF on hepatocytes

2.4給藥48 h后，肝細胞的酶學和生化指標的檢測結果表明:白花丹素的毒性作用可使培養的肝細胞 SOD 下降，NO、MDA、GPT、LDH、GOT 水平升高，而MaFGF則表現出明顯的保護作用，但SOD酶活性、NO、MDA、LDH、GPT、GOT 水平指標尚未能恢復到對照組水平。見Tab 2。

3 討論

中藥抗腫瘤是目前醫學界研究的一個熱點，很多中藥成分被證實具有較好的抗腫瘤效果而得以逐步走向臨床。一般來說，抗腫瘤作用強的藥物細胞毒性也大，而肝臟是外源性藥物代謝、排泄的主要器官，在藥物眾多靶器官中無疑是最重要的。

Tab 2 MDA，SOD，NO，LDH，GPT and GOT changes after 48h culture(±s)

Tab 2 MDA，SOD，NO，LDH，GPT and GOT changes after 48h culture(±s)

＊＊P ＜0.01 vs plumbagin，##P ＜0.01 vs control

Control 5.30 ±0.15 71.78 ±3.12 13.73 ±0.76 12.52 ±0.56 3.87 ±0.39 12.63 ±0.73 Plumbagin 10.31 ±0.36## 57.76 ±3.18## 20.52 ±1.10## 187.27 ±5.67## 321.87 ±14.33## 563.13 ±19.79##Plumbagin+MaFGF 6.68 ±0.32＊＊## 66.09 ±2.77＊＊## 16.09 ±0.90＊＊## 18.39 ±0.56＊＊## 5.13 ±0.58＊＊## 19.49 ±0.76＊＊##

本實驗采用形態學觀察法、MTT法和酶學生化指標檢測白花丹素對肝細胞生長的影響和MaFGF對白花丹素肝毒性的保護作用。

作用 24 h 時，10、20、30、40、50 μg·L－1的白花丹素對肝細胞的抑制率分別為48.26%、51.07%、72.50%、81.07%和91.92%。可以看出，不同濃度的白花丹素對肝細胞的抑制率隨藥物濃度的增大而增加。酶學生化指標也可以有效地反映藥物對細胞的毒性作用。SOD值與藥物毒性大小成負相關;MDA、NO、LDH、GPT和GOT值與藥物毒性成正相關。白花丹素作用后:MDA、NO、LDH、GPT、GOT 的含量升高，而SOD的活性下降，其進一步證實了白花丹素具有一定的肝毒性。究其毒性機制可能有如下原因:肝細胞質膜的脂質過氧化［7］、細胞膜和細胞器破壞、肝酶逸出細胞等。肝臟和腎臟一樣，其氧供應十分豐富，氧自由基產生的機會相對較多，是機體內最容易產生氧自由基損傷的器官之一。而具有細胞毒作用的藥物亦可能對肝、腎細胞的生物膜產生脂質過氧化作用，進而損傷膜功能，改變細胞酶活性，甚至攻擊DNA，觸發凋亡。結合我們的前期工作，慶大霉素腎、耳毒性的產生均與自由基增多有關［8－9］。因此，我們考慮白花丹素致肝毒性也可能與自由基增多相關。

在20 μg·L－1的白花丹素作用 24h 后，分別用4.68、6.24 和 7.80 ×10－3mg·L－1的 MaFGF 處理24 h，肝細胞的抑制率分別為41.85%、33.00%和25.44%;IC50分別是 18.441、31.175、75.373 μg·L－1。從MTT的結果可以看出，白花丹素+不同濃度的MaFGF對肝細胞的抑制率隨MaFGF濃度的增大而減小;IC50隨著MaFGF濃度的增大而明顯增高。通過“相關分析”和“回歸分析”可知，MaFGF對白花丹素的肝毒性的抑制作用具有比較明顯的劑量－效應特點。隨著MaFGF作用濃度的增大，藥物的半數抑制濃度明顯增高，以 7.80×10－3mg·L－1的MaFGF作用24 h的增幅最為明顯。同時，當MaFGF作用后:MDA、NO、LDH、GPT、GOT 明顯下降，而SOD的活性明顯回升，表明MaFGF的保護作用是有效的。而白花丹素+MaFGF組與對照組比較，各生化和酶學指標均未恢復至對照組水平，兩組間差異仍有統計學意義(P＜0.01)，說明MaFGF部分拮抗了白花丹素的毒性作用，使 MDA、NO、LDH、GPT、GOT的含量部分下降，SOD的活性有所升高，但均未能恢復到相對正常水平。

文獻報道MaFGF對由活性氧H2O2引起的心肌細胞損傷具有拮抗作用，能提高SOD活性和降低MDA含量，減少心肌細胞的凋亡，能夠抑制地塞米松誘導的小鼠胸腺細胞凋亡，以劑量依賴方式發揮作用。我們前期研究中發現MaFGF對順鉑、慶大霉素等造成腎小管上皮細胞的損傷具有保護作用，對大鼠腎缺血/再灌注損傷，可明顯減輕腎組織水腫、間質浸潤以及腎小管擴張與破壞，電鏡下見腎小管上皮細胞內細胞器(微絨毛、線粒體、溶酶體等)損傷較輕或基本正常。其發揮作用機制與其直接或間接拮抗自由基的產生，加強其清除和保護抗氧化酶活性有關［10］。

結合我們的前期工作，亟待加強對中藥的毒理學研究，早期發現和掌握該活性成分的有關毒理學資料對于后續研究有著重要的指導意義;進一步開展MaFGF對細胞的理化基礎和分子生物學機制研究:觀察MaFGF的保護作用及其與受體結合機制，探討MaFGF發揮作用的信息傳遞途徑等等。有望在MaFGF對器官損傷的防治作用研究方面實現新的突破。

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