鈣拮抗劑對缺氧/復氧心肌細胞早期生長反應基因的作用及抗損傷的研究

鄭付春，黃展勤，石剛剛

(汕頭大學醫學院1.第一附屬醫院藥劑科、2.醫學院藥理學教研室，廣東汕頭 515041)

Ca2+是細胞信號傳導過程中最常見的“第二信使”，調節各種生理病理過程。有研究者認為細胞內Ca2+濃度升高可引起Egr-1過量表達［1］，Ca2+可通過不同信號傳導途徑調節Egr-1的表達［2－3］。我課題組合成的專利化合物碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)具有良好的拮抗心肌缺血/再灌注(I/R)損傷的作用［4－5］，此作用與其阻斷心肌細胞和血管平滑肌細胞膜鈣通道，防止鈣超載有關［6－7］。進一步研究發現F2可明顯抑制I/R心肌組織Egr-1 mRNA及蛋白表達水平的升高，并同時減輕心肌組織炎性反應及改善心肌功能［8］，表明對I/R狀態下心肌組織內Egr-1過量表達的抑制可能是F2抗I/R損傷的分子機制之一［9］。結合上述概念及報道，具有鈣拮抗作用的藥物是否與F2一樣都可通過抑制Egr-1表達，從而對I/R損傷心肌組織起到保護作用呢，本實驗采用3種不同結構類型的常用鈣離子拮抗劑:維拉帕米、地爾硫卓和硝苯地平，探討它們對缺氧/復氧(H/R)心肌細胞損傷及Egr-1基因和蛋白表達的影響，進一步揭示鈣離子拮抗劑的作用機制。

1 材料與方法

1.1儀器和試劑CO2培養箱(Thermo Forma公司，美國);酶標儀(Thermo Labsystems公司，芬蘭);聚丙烯酰胺凝膠電泳相關材料(Bio-RAD公司，美國);全自動PCR擴增儀(MJ，美國);凝膠成像分析系統(Bio-RAD公司，美國);維拉帕米(恒瑞醫藥股份有限公司，中國);硝苯地平、地爾硫卓(Sigma，美國);TRIzol試劑、PCR 試劑盒(Invitrogen，美國);肌鈣蛋白測試試劑盒(BAYER公司，德國);ELISAS試劑盒(Bender Medsystems公司，瑞士);Egr-1一抗(Santa Crutz公司，美國);辣根過氧化物酶標記的二抗(中杉金橋生物工程公司，中國)。

1.2原代心肌細胞培養1～3 d SD大鼠(汕頭大學醫學院動物中心提供)，♀♂不拘，固定于無菌操作臺上。開胸取心室組織，剪碎至沙粒大小，加入10倍體積的質量分數0.1%胰蛋白酶，37℃消化10 min，組織塊沉降后棄上層液體。組織塊中繼續加入0.1% 的胰蛋白酶，37℃消化10 min，收集上層液體并及時用預冷的體積分數15%小牛血清的培養基滅活殘留胰酶活性;上述消化、收集過程反復4～5次。細胞混懸液，接種至容積為50 ml的培養瓶中，37℃培養30 min以使成纖維細胞貼壁。轉移細胞懸液，接種至培養瓶和96孔板內，同時加入5-BrdU使其終濃度為 0.1 mmol·L－1［6－7］，置 CO2培養箱培養。隔日換液，d 4后培養基改用不含5-BrdU的培養基。

1.3H/R模型的建立及實驗分組:細胞先換用被高純氮氣飽和30 min的缺氧液(137 mmol·L－1NaCl，12 mmol·L－1KCl，0.49 mmol·L－1MgCl2，0.9 mmol·L－1CaCl2·H2O，4 mmol·L－1HEPES，20 mmol·L－1Na lactate)［10］，根據培養容器的大小充入純氮氣，置于缺氧箱中37℃密閉培養3 h，繼續在正常培養基中按常規培養條件培養1 h，造成復氧損傷。取培養 d 5～6的心肌細胞隨機分為對照(Control)組、H/R組、DMSO組、維拉帕米(Ver)組、地爾硫卓(Dil)組、硝苯地平(Nif，用DMSO溶解)組。H/R做缺氧/復氧模型;Ver組、Dil組、Nif組及DMSO組于缺氧液及復氧液中分別給予Ver(2 μmol·L－1)、Dil(10μmol·L－1)、Nif(10 μmol·L－1)及等容積的DMSO。Control組則于實驗前4 h換用體積分數15% 新生牛血清的培養基，CO2培養箱繼續培養。

1.4RT-PCR總RNA的提取用TRIzol試劑法提取總RNA。應用紫外分光光度計進行RNA的濃度、純度測定，通過1% 瓊脂糖凝膠電泳進行RNA樣品完整性的檢測。RT-PCR反應取0.2 ml EP管加入總 RNA 2 μg、隨機引物 1 μl，用無核酸酶水補足至12 μl，70℃孵育5 min后分別加入反應緩沖液4 μl、Ribonuclease inhibitor 1 μl、dNTP 2 μl，25℃ 孵育5 min后加入Revert Aid TM H Minus M-Mulv RT 1 μl，混勻后稍離心，25℃，10 min;42℃，60 min;70℃，10 min，合成cDNA。取0.2 ml EP管加入cDNA 1 μl、2 × Master Mix12.5 μl、應用 β-actin 作為內參照，方法同上僅應用引物為β-actin正義及反義序列，PCR 條件:94℃，3 min;94℃，30 s;55℃，30 s;72℃，1 min;72℃，5 min。擴增30個循環。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像分析系統進行拍照和圖像分析。

1.5Egr-1蛋白測定培養瓶中的細胞PBS洗滌2次，用質量分數0.25% 胰蛋白酶和質量分數0.2%乙二胺四乙酸(V/V，1∶1)消化收集，再次加入PBS漂洗2 次，1 000 r·min－1，離心 10 min(4℃)，棄上清液，沉淀中加入適量的單去污裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r·min－1，離心 10 min(4℃)，取上清液，采用Bradford法測定蛋白濃度。加入5×上樣緩沖液，100℃變性4 min后備用。配制質量分數10% 的分離膠與質量分數5% 的濃縮膠，完全凝固后，每泳道加60 μg蛋白樣品，經電泳(125 V，80 min)和轉膜(350 mA，60 min)后，在封閉液中封閉1 h，然后加入1∶200的Egr-1抗體稀釋液，4℃過夜，緩沖液洗膜3次，每次10 min，再加1∶1 500的二抗稀釋液室溫孵育2 h，洗膜3次，每次10 min，加化學發光試劑于膜上，反應1 min，壓片，曝光后將膠片進行顯影、定影。

1.6心肌細胞損傷及自由基指標測定比色法測定心肌細胞培養上清液中肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)的活性;硫代巴比妥酸法測定心肌細胞丙二醛(MDA)的含量;黃嘌呤氧化酶法測定心肌細胞超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

1.7統計學處理實驗結果用SPSS11.0統計軟件分析，結果以±s表示，采用單因素方差分析進行組間的比較。

2 結果

2.1維拉帕米、地爾硫卓和硝苯地平對Egr-1 mRNA表達水平的影響以Egr-1和β-actin光密度值的百分比來反映各組Egr-1 mRNA的轉錄水平。與Control組相比，H/R組及DMSO組培養大鼠心肌細胞Egr-1 mRNA的表達水平明顯增高(P＜0.01)，Ver組、Dil組及Nif組Egr-1 mRNA的表達較H/R組明顯下調，差異具有統計學意義(P＜0.05)。

Fig 1 Effects of verapamil，diltiazem and nifedipine on expression of Egr-1 mRNA in rat cardiomyocytes

2.2維拉帕米、地爾硫卓和硝苯地平對Egr-1蛋白表達水平的影響以H/R組的灰度值為100%則Control組、DMSO 組、Ver組、Dil組及 Nif組的灰度值分別為(13.56±2.99)%、(99.93±18.14)%、(32.94±7.68)%、(36.89±6.05)% 和(68.84±14.16)%。其中，與Control組比，H/R組和 DMSO組Egr-1蛋白表達增高，差異具有統計學意義(P＜0.05)，與H/R 組比，Ver組、Dil組及Nif組Egr-1蛋白表達明顯減少(P＜0.05)。

Fig 2 Effects of verapamil，diltiazem and nifedipine on expression of Egr-1 protein in rat cardiomyocytes

2.3維拉帕米、地爾硫卓和硝苯地平對培養心肌細胞上清液中CK、LDH活性的影響與Control組比，H/R組及DMSO組培養上清液中CK、LDH活力明顯升高，差異具有顯著性(P＜0.01)。與H/R組比，Ver組、Dil組及Nif組CK、LDH活性均減弱(P＜0.01)。

Tab 1 Comparison of CK and LDH level of cultured medium(±s，n=15)

Tab 1 Comparison of CK and LDH level of cultured medium(±s，n=15)

＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs H/R group

Group CK/kU·L－1 LDH/kU·L －1 Control 12.64 ±2.89 3019.84 ±297.4 H/R 57.18 ±9.32＊＊ 6940.04 ±407.7＊＊DMSO 55.04 ±5.16＊＊ 7003.74 ±570.3＊＊Ver 23.12 ±5.07## 3855.27 ±233.3##Dil 26.48 ±6.15## 4185.66 ±316.7##Nif 32.36 ±7.40## 4564.02 ±402.4##

2.4維拉帕米、地爾硫卓和硝苯地平對心肌細胞中SOD活性和MDA含量的影響與Control組比，H/R組及DMSO組心肌細胞中SOD活力明顯降低，MDA含量明顯升高，差異具有顯著性(P＜0.01)。與H/R組比，Ver組、Dil組及Nif組MDA含量降低(P＜0.01)，SOD 活力增高(P＜0.05)。

Tab 2 Comparison of SOD and MDA level of cultured cardiomyocytes(±s， n=12)

Tab 2 Comparison of SOD and MDA level of cultured cardiomyocytes(±s， n=12)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs H/R group

Group SOD/kU·g－1Pro MDA/μmol·g－1Pro Control 29.15 ±7.63 0.20 ±0.05 H/R 15.08 ±2.08＊＊ 0.99 ±0.29＊＊DMSO 16.14 ±2.29＊＊ 1.02 ±0.28＊＊Ver 26.99 ±8.03## 0.41 ±0.11##Dil 25.26 ±7.19## 0.44 ±0.14##Nif 20.80 ±6.37# 0.61 ±0.18##

3 討論

大量文獻報道，Egr-1的高表達與I/R損傷密切相關。采用基因敲除或反義寡核甘酸技術，為Egr-1的誘導和I/R損傷之間的因果關系提供了直接的證據［10－11］。實驗結果表明，I/R可誘導的 Egr-1表達上調，異常表達的Egr-1又可進一步誘導一系列下游基因的表達，包括白細胞介素(IL)1、巨噬細胞炎性蛋白2(MIP2)、細胞間黏附分子1(ICAM1)、組織因子(TF)、纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI1)和血管內皮生長因子(VEGF)等，這些因子隨后啟動的炎性反應、凝血和血管高通透性正是I/R組織損傷的三大典型病理變化［10－11］。我們以往的研究與Yan等［10］研究結果基本一致，表明Egr-1的表達上調可能是I/R組織的一種共性表現。

心肌H/R損傷的發生與細胞內鈣超載有密切關系。鈣超載是指Ca2+在細胞內大量積聚，引起組織器官嚴重的結構及功能障礙，是心肌H/R損傷的特征之一。有不少文獻報道［12］，心肌I/R損傷時應用鈣離子拮抗劑能拮抗這些損傷，從而對心肌起到良好的保護作用，改善心功能。本實驗的結果亦顯示，維拉帕米、地爾硫卓和硝苯地平3種經典的鈣通道拮抗劑都能抑制心肌酶LDH和CK的釋放，降低H/R心肌細胞內的MDA含量，提高SOD活性，防止細胞內氧自由基的過量產生，減輕心肌細胞的脂質過氧化，從而起到對H/R心肌細胞的保護作用。結果顯示，H/R所致的心肌細胞Egr-1 mRNA和蛋白的過量表達可被維拉帕米、地爾硫卓和硝苯地平所抑制，Ca2+可通過不同的機制直接或間接影響Egr-1的轉錄表達，這可能是鈣離子拮抗劑保護心肌細胞(H/R)損傷的共同機制之一。

本實驗采用H/R心肌細胞作為模型觀察維拉帕米、地爾硫卓和硝苯地平對Egr-1的調節及心功能的作用。較比心肌組織的觀察，條件更易控制，結果更加精確可靠，充分驗證了心肌組織的結果。從結果看，它們的作用大小并不完全相同，維拉帕米對Egr-1 mRNA和蛋白的抑制率分別為71%、67%，地爾硫卓為66%、63%，兩種作用基本相同，硝苯地平為35%、32%，作用相對較弱;心肌細胞損傷指標測定結果也出現相同趨勢。這可能與3種拮抗劑各自的作用機制有關，盡管3種藥物都是L型鈣通道拮抗劑，都能通過抑制Egr-1 mRNA和蛋白表達拮抗心肌細胞H/R損傷，其中維拉帕米、地爾硫卓主要作用于心肌細胞的L型鈣通道，而硝苯地平主要作用于血管平滑肌細胞的L型鈣通道，對心臟的直接作用較小。鈣作為Egr-1表達的上游調控因子，由于上述鈣拮抗劑對不同組織的鈣通道的阻斷強度不一，也就造成了Egr-1表達的差異，這可能是導致拮抗心肌細胞損傷不同的原因之一。另外，預實驗表明，維拉帕米、硝苯地平和地爾硫卓的濃度分別2、10及10 μmol·L－1時作用較強，本實驗中各拮抗劑采用以上濃度。

我課題組前期F2的研究和本實驗的結果提示我們在研究鈣拮抗劑作用于“第二信使”鈣離子時，應進一步研究它對核轉錄因子(第三信使)及下游因子的作用，這對于詳盡探討鈣拮抗劑作用機制將是非常有意義的。

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