吲哚-3-原醇對(duì)復(fù)合因素所致肝纖維化大鼠的治療作用及部分機(jī)制研究

高愛梅，平 潔，2，汪 暉，2

(武漢大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系、2.食品與藥品評(píng)價(jià)研究中心，湖北 武漢 430071)

肝纖維化是各種致病因素引起肝臟慢性炎癥、壞死、纖維組織持續(xù)增生的病理過程，其發(fā)病與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的合成和降解失衡，在肝臟內(nèi)過度沉積有關(guān)。肝纖維化是肝硬化的早期病理改變和必經(jīng)階段，其發(fā)生、發(fā)展是影響諸多肝病預(yù)后和轉(zhuǎn)歸的關(guān)鍵。吲哚-3-原醇(indol-3-carbinol，I3C)是葡萄糖蔓芹苷的前體，大量存在于十字花科類食用蔬菜如西蘭花等。研究發(fā)現(xiàn)，I3C有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡、清除氧自由基和抗脂質(zhì)過氧化等作用［1－2］，常用來治療胸部、消化道、肝臟和前列腺等處的腫瘤［3－4］。有研究報(bào)道［5－6］，I3C對(duì)二甲基亞硝胺、四氯化碳誘導(dǎo)的急性肝損傷有保護(hù)作用。本室前期分別在肝切片和細(xì)胞水平，證實(shí)I3C對(duì)肝細(xì)胞有保護(hù)作用，且能抑制ECM的主要來源細(xì)胞—肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)的增殖［7－8］。然而，其對(duì)整體動(dòng)物肝纖維化是否有保護(hù)作用，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究在整體水平觀察I3C對(duì)復(fù)合因素所致大鼠肝纖維化的治療作用，并初步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1試劑與藥品I3C，美國Sigma公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒、羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所;α-平滑肌肌動(dòng)蛋白多克隆抗體(αsmooth muscle actin，α-SMA)免疫組化 SP法試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;堿性磷酸酶、Western blot顯色劑購自Hyclone公司?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)多克隆抗體購自Santa Cruz公司。GAPDH單克隆抗體購自上?？党缮锛夹g(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物♂Wistar大鼠，體質(zhì)量200～220 g，由湖北省疾病預(yù)防中心提供，SPF級(jí)，許可證號(hào):SCXK(鄂)2006-2008。

1.3實(shí)驗(yàn)方法48只♂Wistar大鼠，隨機(jī)分成6組，每組8只:正常對(duì)照組、I3C對(duì)照組、模型對(duì)照組、I3C小劑量組、I3C中劑量組、I3C大劑量組。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除正常對(duì)照組和I3C對(duì)照組外，所有動(dòng)物給予高脂低蛋白飼料(89.5%玉米粉，0.5%膽固醇，10%豬油)，并飲用5% ～10%乙醇溶液(前3天5%乙醇，以后10%乙醇)。1周后首次皮下注射 40%CCl4橄欖油 5 ml·kg－1，以后每周兩次(周一、周四)注射3 ml·kg－1，連續(xù)3周。造模結(jié)束后，I3C小、中、大劑量組及I3C對(duì)照組分別腹腔注射I3C 3、6、12 和12 mg·kg－1，正常及模型對(duì)照組皮下注射等容量橄欖油(1 ml·kg－1)。連續(xù)給藥10 d后，斷頭處死動(dòng)物，取血 3 ～5 ml，3 500 r·min－1離心10 min，制備血清，－20℃凍存;于肝右葉取肝組織，一部分用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，4～7 μm厚連續(xù)切片做病檢，余下的肝組織－80℃凍存。

1.4檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1大鼠一般情況及生化指標(biāo)的檢測(cè)包括大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)、皮毛光澤、食量及糞便等以及肝臟的外觀、顏色和質(zhì)地。按試劑盒說明比色法，測(cè)定肝組織Hyp、SOD和MDA的水平。

1.4.2病理學(xué)檢測(cè)部分肝組織以4%多聚甲醛固定后，石蠟包埋，切片，作HE染色及Masson三色染色，觀察肝臟病理學(xué)改變及膠原含量。免疫組化SP法檢測(cè)肝臟α-SMA的表達(dá)。切片常規(guī)脫蠟至水，0.01 mol·L－1檸檬酸鹽緩沖液微波修復(fù)5 min，加入3%H2O2室溫下孵育15 min，正常兔血清37℃封閉15 min;加一抗α-SMA多克隆抗體(1∶200)，37℃孵育2 h;滴加生物素化二抗，37℃孵育20 min;滴加三抗，37℃孵育20 min;DAB顯色，蘇木精復(fù)染核，逐級(jí)脫水，透明，封片。胞質(zhì)染成棕黃色為陽性細(xì)胞。在顯微鏡下每張玻片選取5個(gè)10×40倍視野，輸入HMIAS-2000高清晰彩色圖文分析儀(武漢千屏影像技術(shù)公司)，檢測(cè)陽性細(xì)胞區(qū)域面積。

1.4.3Western blot分析肝勻漿中MMP-2的表達(dá)

肝臟用組織裂解液勻漿后，BCA法測(cè)蛋白，取適量的蛋白樣本進(jìn)行SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素(NC)膜上，用封閉液封閉1 h;加入1∶100稀釋的MMP-2一抗，室溫孵育2 h;取出NC膜洗滌后，再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗孵育1 h;洗滌后加底物，顯色，終止吸干。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行分析。圖表制作以Prism 5.0軟件操作。

2 結(jié)果

2.1大鼠一般情況整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，無大鼠死亡。正常對(duì)照組及I3C對(duì)照組大鼠毛順有光澤，活潑好動(dòng)，食量及大便正常;模型對(duì)照組大鼠皮毛疏松無光澤，精神萎靡，懶動(dòng)，飲食減少，大便干燥松散不成形;I3C治療組一般狀態(tài)較模型對(duì)照組有所減輕。

2.2肝臟組織病理學(xué)

2.2.1肝臟外觀正常對(duì)照組和I3C對(duì)照組大鼠肝臟被膜光滑，呈紅褐色，質(zhì)地中等;模型對(duì)照組大鼠肝臟偏黃白色，油膩，無光澤，質(zhì)地偏硬，部分表面輕度桔皮樣變。經(jīng)I3C治療后，大鼠肝臟桔皮樣變減輕，肝臟色澤、質(zhì)地有不同程度改善。

2.2.2肝切片HE染色正常對(duì)照組(Fig 1A)及I3C對(duì)照組(Fig 1D)大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索整齊，肝竇正常，無炎性細(xì)胞浸潤及纖維組織增生;模型對(duì)照組(Fig 1B)大鼠肝索紊亂，炎細(xì)胞浸潤和組織壞死明顯，彌漫的脂肪變性，纖維組織大量增生，形成粗細(xì)不一的纖維間隔并向小葉內(nèi)延伸;各給藥組(Fig 1C)炎細(xì)胞浸潤，組織壞死減輕，部分肝小葉結(jié)構(gòu)恢復(fù)，肝索排列較規(guī)則，纖維間隔縮短變窄，纖維化分期下降。

2.3肝臟膠原改變

2.3.1肝切片Masson染色正常對(duì)照組(Fig 2A)和I3C對(duì)照組(Fig 2D)僅有少量膠原表達(dá)于中央靜脈壁及匯管區(qū);模型對(duì)照組(Fig 2B)可見膠原纖維大量沉積于匯管區(qū)，并沿匯管區(qū)向外延伸，形成厚薄不一的纖維間隔，分割包繞肝小葉，局部有假小葉形成;與模型對(duì)照組相比，I3C給藥組(Fig 2C)肝小葉結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，肝索排列較整齊，膠原沉積明顯減少，纖維間隔變薄。Masson圖像分析(Fig 3)也證實(shí)，I3C能明顯降低大鼠肝組織膠原纖維的含量(P＜0.05)。

Fig 1 Effects of indole-3-carbinol(I3C)on liver histopathology(HE staining)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats(200×)

Fig 2 Effects of indole-3-carbinol(I3C)on liver collagen secretion(Masson’s trichrome staining)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats(200×)

Fig 3 Effects of 3，6 and 12 mg·kg-1indole-3-carbinol(I3C)on liver collagen percentage in multiple hepatotoxic factors-induced rat liver fibrosis by semiquantitative analysis using Medical Color Image Analysis System(±s，n=4)

2.3.2肝臟Hyp含量的變化與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組Hyp含量明顯升高(P＜0.01);I3C各治療組可改善肝纖維化程度，降低肝組織Hyp含量(Tab 1)。

Tab 1 Effects of indole-3-carbinol(I3C)on hydroxyproline(Hyp)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats(±s，n=8)

Tab 1 Effects of indole-3-carbinol(I3C)on hydroxyproline(Hyp)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats(±s，n=8)

＊＊P ＜0.01 vs normal control.

Group Dose/mg·kg－1 Hyp/mg·g －1 Normal control － 125±16 Fibrotic control － 352±96＊＊Fibrotic+I3C 3 303±95 Fibrotic+I3C 6 259±131 Fibrotic+I3C 12 316±75 I3C control 12 166±23

2.4肝切片α-SMA免疫組化正常對(duì)照組(Fig 4A)和I3C對(duì)照組(Fig 4D)僅見α-SMA在血管壁及肝血竇Disse間隙內(nèi)少量表達(dá)，模型對(duì)照組(Fig 4B)α-SMA表達(dá)明顯，主要分布于竇周、膠原沉積處、纖維間隔處，I3C治療組(Fig 4C)α-SMA在表達(dá)范圍、強(qiáng)度上都減輕，且表現(xiàn)為一定的量效關(guān)系(Fig 5)。

Fig 4 Effects of indole-3-carbinol(I3C)on expressions of α-smooth muscle actin(α-SMA)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats(200×)

Fig 5 Effects of 3，6 and 12 mg·kg-1indole-3-carbinol(I3C)on expressions of α-smooth muscle actin(a-SMA)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats by semiquantitative analysis using Medical Color Image Analysis System(±s，n=3)

2.5肝勻漿MMP-2的Western blot分析Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，72 ku處顯示清晰的條帶為MMP-2(Fig 6)，與正常組比較，模型對(duì)照組MMP-2降低，與模型對(duì)照組比較，給藥組MMP-2升高，尤以I3C大劑量組明顯。

Fig 6 Western blot analysis of matrix metalloproteinases-2(MMP-2)of indole-3-carbinol(I3C)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats

2.6肝組織抗氧化指標(biāo)與正常對(duì)照組比，模型對(duì)照組MDA含量明顯升高，SOD活性明顯降低(P＜0.01);與模型對(duì)照組比，I3C治療組可升高SOD活性，尤以大劑量組明顯(P＜0.01)。見Tab 2。

3 討論

慢性肝損傷模型主要有CCl4、白蛋白、乙醇和復(fù)合因素慢性肝損傷模型。復(fù)合因素中的3種因素(CCl4、乙醇、高脂低蛋白飼料)均能損傷肝細(xì)胞，長期給予CCl4、乙醇、高脂低蛋白飼料后，損傷的肝臟可進(jìn)一步發(fā)生纖維化，較單因素模型具普遍性和現(xiàn)實(shí)意義，能更準(zhǔn)確模擬自然生活環(huán)境，適用于抗肝纖維化的藥物作用研究。本實(shí)驗(yàn)中，復(fù)合因素處理大鼠4周后即可見肝細(xì)胞脂肪變性明顯，肝臟門管區(qū)纖維組織增生，部分伸入肝小葉，同時(shí)肝指數(shù)和肝臟Hyp含量明顯升高，說明本實(shí)驗(yàn)中肝纖維化模型的復(fù)制是成功的。

Tab 2 Effect of indole-3-carbinol(I3C)on liver homogenate SOD and MDA in rats(±s，n=8)

Tab 2 Effect of indole-3-carbinol(I3C)on liver homogenate SOD and MDA in rats(±s，n=8)

＊＊P ＜0.01 vs normal control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs fibrotic control.

Group Dose/mg·kg－1 MDA/μmol·g－1Pro SOD/kU·g－1Pro Normal control － 3.3 ±0.9 146±16 Fibrotic control － 5.4 ±1.7＊＊ 124±13＊＊Fibrotic+I3C 3 4.8 ±2.0 133 ±11 Fibrotic+I3C 6 7.7 ±2.2 155 ±42#Fibrotic+I3C 12 11.2 ±5.4 193 ±17##I3C control 12 4.3 ±1.2 120 ±40

有報(bào)道，I3C對(duì)二甲亞硝胺、CCl4所致的急性肝損傷有保護(hù)作用［5－6］，那么 I3C對(duì)慢性肝損傷是否同樣具有保護(hù)作用呢?本研究利用復(fù)合因素所致大鼠肝纖維化模型，觀察了I3C對(duì)肝纖維化的治療作用。HE染色結(jié)果顯示，I3C能夠部分改善肝細(xì)胞的變性和壞死程度，促進(jìn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。

已知自由基的大量生成和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加重是CCl4致肝細(xì)胞毒性的主要細(xì)胞機(jī)制，而且在CCl4致大鼠肝纖維化模型中發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)與纖維生成呈明顯正相關(guān)［9］。此外，乙醇的代謝產(chǎn)物，如乙醛，能夠直接誘導(dǎo)HSC活化和膠原纖維的生成［10］。在本研究中，我們通過檢測(cè)肝組織中 MDA含量和SOD活性，證實(shí)了復(fù)合因素所致肝纖維化形成過程中脂質(zhì)過氧化反應(yīng)加重。肝纖維化大鼠經(jīng)I3C治療后，小劑量組MDA含量有所降低，SOD活性則明顯增加，且呈一定的量效關(guān)系，提示I3C對(duì)肝細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，使其抗氧化能力增強(qiáng)。

HSC的激活是肝纖維化形成的關(guān)鍵，本研究觀察了 HSC 活化的特異性標(biāo)志物——α-SMA［11］。首先，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察了α-SMA在肝組織中的定位表達(dá)情況，研究結(jié)果顯示，I3C給藥組α-SMA的陽性表達(dá)比模型對(duì)照組明顯減少，半定量分析結(jié)果亦顯示出顯著性差異，且呈現(xiàn)良好的劑量依賴性，說明I3C可減少活化HSC的數(shù)量，阻斷肝纖維化形成的始動(dòng)階段。

此外，膠原作為一種ECM，是纖維化肝臟的主要成分之一［11］?；罨腍SC合成大量膠原，使肝臟的膠原合成與降解失衡，而Hyp被認(rèn)為是膠原的主要成分，因此本研究通過測(cè)定肝組織Hyp的含量來間接反映HSC激活和肝內(nèi)膠原情況。結(jié)果顯示，模型對(duì)照組大鼠肝組織Hyp含量較正常對(duì)照組明顯增加，而各給藥組Hyp含量則有不同程度的下降，這與Masson三色染色所觀察到的肝臟膠原含量的半定量分析結(jié)果一致。肝纖維化是ECM合成大于降解，在肝臟內(nèi)過度沉積所致。ECM的合成和降解過程主要由基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)/MMPs這對(duì)平衡劑來調(diào)節(jié)。MMPs可降解ECM，亦可以被內(nèi)源性抑制因子 TIMPs 所抑制［12－13］。文獻(xiàn)報(bào)道［14］，肝纖維化恢復(fù)期，由于HSC的凋亡，TIMPs表達(dá)減少，其對(duì)MMPs的抑制作用也減弱，MMPs活性增強(qiáng)，膠原降解增加，肝纖維化逆轉(zhuǎn)。本研究檢測(cè)肝勻漿MMP-2蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)I3C能促進(jìn)MMP-2表達(dá)。以上結(jié)果說明I3C能夠增強(qiáng)MMPs活性，促進(jìn)ECM降解，降低肝臟膠原沉積，促進(jìn)肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。

目前I3C在臨床上主要用于腫瘤的輔助治療。臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已證實(shí)，I3C毒副作用小，安全范圍較寬。本研究發(fā)現(xiàn)，I3C對(duì)照組與正常對(duì)照組在病理檢查和生化指標(biāo)上幾無差別，說明I3C在本研究受試濃度下較為安全。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)I3C能有效的治療復(fù)合因素所致的大鼠肝纖維化，其機(jī)制與其增強(qiáng)MMPs活性，促進(jìn)ECM降解，并抗氧化有關(guān)。

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