低分子肝素對慢性阻塞性肺病大鼠模型氣道炎癥與重塑的實驗研究

陳 霞 徐德祥 程兆忠

（1 青島市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科；山東 青島 266042；2 青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院東區(qū)呼吸內(nèi)科山東 青島 266042）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是一種慢性呼吸系統(tǒng)疾病，患病人數(shù)多，病死率高，社會經(jīng)濟負擔重，已成為一個全球性的重要的公共衛(wèi)生問題。如何防止C0PD的發(fā)生、阻止或延緩其發(fā)展是目前非常重要的研究課題。 COPD以不完全可逆的氣流受限為特點，氣道、肺實質(zhì)的慢性炎癥是它的特征性改變，炎癥導致氣道壁的損傷-修復過程反復發(fā)生，進而引起氣管結(jié)構(gòu)重塑、膠原含量增加及瘢痕形成。本實驗通過大鼠模型，研究觀察低分子肝素（LMWH）對COPD大鼠模型細胞間黏附分子-1（ICAM-1）和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）表達的影響[1]，以及對COPD氣道炎癥與重塑的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物模型建立

選用健康雄性Wistar大鼠30只，鼠齡12周，體質(zhì)量（200±20）g，由青島市藥檢所動物實驗中心提供，隨機分為三組：①正常對照組：10只，不進行任何干預。②COPD模型組：10只。分別于第1、14天氣管內(nèi)注入脂多糖（LPS，美國Sigma公司）200ug，第2到40天（第14d除外）將大鼠放入（80cm×60cm×50cm）大小的有機玻璃熏箱內(nèi)被動吸煙，每日熏煙兩次，每次10支香煙（將軍牌香煙，焦油含量15mg/支、煙氣煙堿量1.2mg/支，山東中煙工業(yè)公司），時間持續(xù)1h，兩次熏煙間隔時間4h。熏煙前0.5h并給予1mL生理鹽水皮下注射，1次/日[2]。③LMWH干預組：10只。模型制備同前，但熏煙前0.5h用低分子肝素（法安明，輝瑞比利時公司），劑量為150U/kg，稀釋至1mL皮下注射，1次/日。

1.2 檢測方法

1.2.1 病理學檢查

取右肺下葉，生理鹽水沖洗后，置于40g/L的中性甲醛溶液內(nèi)固定48h，脫水、浸蠟、包埋、切片，行蘇木素一伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肺組織病理改變。

1.2.2 肺組織小氣道管壁厚度的測量

將每張片置于同一高倍視野下隨機選取管徑在100～200um的小支氣管，隨機選取1個視野，測量其中5個小氣道壁厚度，鏡下每個小氣道壁各選取3、9點位置，求其平均值。

1.2.3 ICAM-1、TGF-β1的檢測

采用免疫組化方法上測ICAM-1、TGF-β1的表達。結(jié)果采用多功能彩色病理圖象分析系統(tǒng)處理，每張切片在同一高倍視野下隨機選擇含5個視野，測量支氣管肺組織陽性染色區(qū)域的平均積分光密度值，取5個視野的平均值來代表所測指標的蛋白表達情況[3]。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16 對結(jié)果進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用方差分析，P＜0.05認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 病理比較

所建COPD模型的病理學改變符合人類COPD的特點。健康對照組大鼠活潑好動，皮毛光澤無脫落；COPD模型組及LMWH干預組大鼠毛發(fā)失去光澤，黃澀，神情倦怠，活動能力下降。COPD模型組呈慢性支氣管炎、肺氣腫的特征性病理學改變；LMWH干預組大鼠支氣管肺組織損傷的程度較COPD模型組輕。與正常對照組比較，COPD模型組氣道壁增厚，LMWH干預組與COPD模型組比較氣道壁變薄，見表1所示。

表1 各組大鼠氣道壁厚度的比較（±s）

表1 各組大鼠氣道壁厚度的比較（±s）

注：與正常對照組比較，★P＜0.01；與COPD模型組比較，▲P＜0.01

組別 n 氣道壁的厚度（um）正常對照組 10 16.63±0.05 COPD模型組 10 28.31±0.06★LMWH干預組 10 25.67±0.04▲

2.2 ICAM-1、TGF-β1的表達比較

與正常對照組比較，COPD模型組ICAM-1、TGF-β1表達增強；與COPD模型組比較，LMWH干預組ICAM-1、TGF-β1表達減弱，差異有統(tǒng)計學意義，見表2。

表2 各組支氣管肺組織ICAM-1和MCP-1的表達結(jié)果比較（±s）

表2 各組支氣管肺組織ICAM-1和MCP-1的表達結(jié)果比較（±s）

注：與正常對照組比較，★P＜0.01；與COPD模型組比較，▲P＜0.01，◆P＜0.05

組別 n ICAM-1 TGF-β1正常對照組 10 0.24±0.05 0.13±0.04 COPD模型組 10 0.42±0.06★ 0.27±0.07★LMWH干預組 10 0.31±0.04▲ 0.20±0.08◆

3 討 論

黏附分子是一類介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質(zhì)相互黏附的糖蛋白。眾多機體炎性防御、炎性損傷過程均通過細胞間黏附才能完成。ICAM-1屬黏附分子中的免疫球蛋白超家族，正常情況下ICAM-1呈低水平表達，但當受到炎癥因子LPS、γ干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子（TNF-α）的刺激時，其表達短期內(nèi)迅速增加，ICAM-1上調(diào)表達后，介導白細胞的貼壁滾動、附著、黏附和轉(zhuǎn)移，使白細胞經(jīng)內(nèi)皮細胞游出血管內(nèi)壁進入炎癥組織，并釋放大量組織、炎性因子等，對組織造成損傷。目前較多研究發(fā)現(xiàn)[4]，ICAM-1在COPD患者支氣管肺泡灌洗液、痰、血漿和肺組織中均有一定程度的升高，表明ICAM-1參與了白細胞在呼吸道募集，參與了COPD的炎癥過程。

本研究通過被動吸煙加氣管內(nèi)注入脂多糖法建立COPD大鼠模型，將LMWH應用于COPD大鼠模型的早期干預治療，大鼠肺組織病理較COPD模型組大鼠減輕，說明LMWH在一定程度上可減輕COPD肺組織損傷。肺組織中ICAM-1及TGF-β1的表達水平顯著下降，推測LMWH可能通過降低ICAM-1及TGF-β1的表達，減輕氣道炎性反應，延緩氣道重塑。

有研究表明，LMWH除了公認的抗凝血、抗血栓作用，還具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑制細胞增殖、抗腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學活性和藥理作用。在COPD發(fā)生發(fā)展過程中，支氣管以及肺組織的炎性損傷、修復和重塑是連續(xù)的不可分割的病理生理過程。氣道平滑肌的增生肥厚，細胞外基質(zhì)的異常沉積，上皮下層纖維化等結(jié)構(gòu)的改變，進而引起氣道阻力增加，氣道彈性降低，順應性下降等。TGF-β1是屬于一組新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細胞生長和分化的TGF-β超家族[5]，是一種重要的致纖維化細胞因子， 除了具有增加細胞外基質(zhì)沉積的作用以外，還具有促進氣道平滑肌細胞增殖的作用，在氣道重建中具有雙重的作用。Takizwa等[6]學者使用超細纖支鏡對吸煙者和COPD患者小氣道上皮檢查發(fā)現(xiàn)TGF-β1的表達與對照組比較明顯升高，而且與吸煙史及氣道阻塞程度呈正相關(guān)。與本次的研究結(jié)果類似。應用LMWH干預后，COPD大鼠的肺組織損傷減輕，可延緩大鼠病情進展。大鼠模型表明LMWH對緩解慢性阻塞性肺疾病進程有重大意義，需要在臨床中進一步研究和探討。

[1] 陳丕仁,崔力,候加法.慢性阻塞性肺病動物模型的研究進展[J].中國實驗動物學報,2007,15(3):238-242.

[2] 馬楠,崔德健,梁延杰.氣道內(nèi)注入脂多糖法建立大鼠慢性支氣管炎模型[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,1999,22(6):371-372.

[3] 宋一平,崔德健,茅培英.慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立及藥物干預的影響[J].軍醫(yī)進修學院學報,2001,22(1):99-102.

[4] Rachel A,Brown,Luigi A.Additional clinical benef i t of enoxaparin in COPD patients receiving Salmeterol and fl uticasone propionate in combination[J].Pulmonary Pharmacology Theraperties,2006,19(6):4l9-424.

[5] 李斌,佟麗,程兆忠. 低分子肝素對COPD模型大鼠MMP-9及TIMP-1影響[J].青島大學醫(yī)學院學報,2009,(05):430-432.

[6] Takizwa H,Tanaka M,Tak K,et a1.Increased expression oftransforrming growth factorβ1 in small airway epithelium from tobacco smokers and patients with chronic obstructive pulmonary disease(COPD)[J].Am J Respir Cf i t Care Med,2009,163(6):1476-1483.