鹽酸小檗堿與氟康唑協(xié)同抗耐藥白念珠菌的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

權(quán) 華，趙靖霞，徐 錚，姜遠(yuǎn)英

近年來真菌感染率急劇上升，致病性真菌種類增多，但白念珠菌（Candida albicans）仍然是臨床最常見的致病性真菌，約占所有醫(yī)院真菌感染的50%～60%[1，2]。系統(tǒng)性白念珠菌感染病死率高達(dá)38%，是引起癌癥患者和艾滋病患者病死的主要原因。由于抗真菌藥物有限，科研工作者在不斷試圖開發(fā)新型抗真菌藥物，目前氟康唑仍然是臨床上治療白念珠菌感染的首選藥物，這是由于它具有無可替代的優(yōu)勢：生物利用度高（>90%），組織分布廣，不良反應(yīng)少，深部真菌感染療效好等。隨著氟康唑長期、大量應(yīng)用于真菌感染的預(yù)防及治療，導(dǎo)致白念珠菌耐藥性普遍產(chǎn)生，成為臨床治療失敗的主要原因[3]。為解決以上問題，抗真菌藥的聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)成為臨床抗真菌治療的發(fā)展方向之一。在筆者前期的體外實(shí)驗(yàn)中，針對(duì)臨床耐藥白念珠菌0304103菌株的生長曲線實(shí)驗(yàn)顯示鹽酸小檗堿與氟康唑合用的抑菌作用具有小檗堿劑量依賴性，而且體外瓊脂平板擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)、時(shí)間-殺菌曲線，以及對(duì)40株菌的棋盤式微量稀釋實(shí)驗(yàn)充分證實(shí)了鹽酸小檗堿與氟康唑合用對(duì)臨床耐藥白念珠菌的協(xié)同作用[4]。因此本研究主要針對(duì)臨床耐藥白念珠菌，從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了鹽酸小檗堿與氟康唑合用具有協(xié)同抗真菌作用，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 臨床耐藥白念珠菌編號(hào)0304103，由長海醫(yī)院真菌室提供，并經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定。

1.1.2 藥物 氟康唑注射液（2 mg/ml）由上海信誼金朱藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，鹽酸小檗堿由上海利生制藥廠提供。氟康唑注射液、鹽酸小檗堿分別以PBS稀釋或溶解，配制用藥。

1.1.3 動(dòng)物 遠(yuǎn)交系ICR小鼠90只， 雌性，6～8周，18～22 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，清潔級(jí)（許可證號(hào)：SCXK9(滬)2003）。

1.1.4 儀器 HZQ-F160全溫振蕩培養(yǎng)箱 （江蘇太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），Biofuge stratos高速冷凍離心機(jī)（Heraeus），Leica RM2135石蠟切片機(jī) （德國 Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠系統(tǒng)性真菌感染模型的建立 從長海醫(yī)院真菌室菌液中接種臨床白念菌株0304103，在YEPD培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜，使其達(dá)到指數(shù)生長期末期，再活化2次，以1%接種到新鮮的YEPD 培養(yǎng)基中，即10 mlYEPD中加100 μl菌液于100 ml錐形瓶中培養(yǎng)16 h，1000×g離心5 min，用0.9%生理鹽水洗滌3次至上清液無色，去上清，以0.9%生理鹽水調(diào)至菌液濃度為5×106CFU/ml。尾靜脈注射真菌溶液0.1 ml/10 g造成ICR小鼠系統(tǒng)性真菌感染。

1.2.2 分組給藥并觀察存活時(shí)間 90只ICR小鼠隨機(jī)分為6組，15只/組，分別為真菌感染模型組（空白對(duì)照組）、氟康唑（0.5 mg/kg）單用治療組、鹽酸小檗堿（9 mg/kg）單用治療組、鹽酸小檗堿（1 mg/kg）合用氟康唑（0.5 mg/kg）治療組（簡稱合用 1組）、鹽酸小檗堿（3 mg/kg）合用氟康唑（0.5 mg/kg）治療組（簡稱合用2組）以及鹽酸小檗堿（9 mg/kg）合用氟康唑（0.5 mg/kg）治療組（簡稱合用3組）。在小鼠系統(tǒng)性真菌感染模型建立2 h后，各給藥組分別腹腔注射給藥0.2 ml/10 g，模型組（空白對(duì)照組）腹腔注射溶劑PBS0.2 ml/10 g，1次/d，連續(xù)給藥7 d。觀察小鼠死亡情況，記錄存活時(shí)間，計(jì)算每天各組存活百分率，共觀察35 d后，將存活小鼠麻醉后處死，真菌感染小鼠的尸體全部澆乙醇火燒處理。

1.2.3 腎臟活菌落數(shù)目（CFU）檢測 給藥7 d后停藥，最后一次給藥24 h后處死30只（5只/組），取雙腎臟，稱重后，剪開，以5ml 0.9%生理鹽水勻漿，再分別以0.9%生理鹽水將勻漿液稀釋103、104倍等，得到不同數(shù)量級(jí)稀釋倍數(shù)的勻漿液，各取100 μl涂鋪于SDA平皿上，于30℃真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)菌落數(shù)目，以SDA平皿上生長菌落數(shù)達(dá)20個(gè)為最低限。計(jì)算腎臟活菌落數(shù)目（CFU），以log10 CFU/g 作圖，并做 Student's t test檢驗(yàn)[4]。

計(jì)算公式：CFU/g=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×50/腎重量（g）。

1.2.4 腎臟組織切片病理檢查 給藥7 d后停藥，最后1 d給藥24 h后麻醉并頸部脫臼處死30只真菌感染ICR小鼠，每組5只，取腎臟，腎臟組織經(jīng)由10%中性緩沖福爾馬林液中固定、取材、酒精梯度脫水、石蠟包埋、切片，厚度10 μm，切片做HE染色（蘇木素－伊紅染色），于顯微鏡下觀察腎臟組織病理變化并拍照片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)算腎臟活菌落數(shù)目（CFU），以log10 CFU/g計(jì)算，t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 系統(tǒng)性真菌感染小鼠的治療存活時(shí)間 鹽酸小檗堿單獨(dú)治療組的平均存活時(shí)間與模型組無顯著性差異（P>0.05），分別為3.5 d和3.4 d。氟康唑單獨(dú)治療組平均存活時(shí)間9.9 d，合用1組平均存活時(shí)間為12.7 d，合用2組平均存活時(shí)間16.1 d（圖1、2），合用 3組平均存活時(shí)間 18.7 d（圖2、3）。 兩藥合用組的存活時(shí)間明顯長于氟康唑單獨(dú)治療組，其中合用2、3組與氟康唑單獨(dú)治療組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05 或 0.01）。

圖1 合用1組生存率比較線圖

圖2 合用2組生存率比較線圖

圖3 合用3組生存率比較線圖

2.2 真菌感染小鼠腎臟的活菌數(shù)檢測和腎臟組織病理檢查 腎臟的活菌數(shù)檢測換算為log10CFU/g作圖（圖4），鹽酸小檗堿單獨(dú)治療組的log10CFU/g平均值6.566與模型組6.462相比沒有顯著性差異 （P>0.05）。單獨(dú)氟康唑組活菌數(shù)平均值為5.966，合用1～3 組活菌數(shù)平均值分別為：5.723、5.645、4.967，均與單獨(dú)氟康唑組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P<0.05或0.01）。尤其高劑量小檗堿與氟康唑合用組療效更好（圖4）。

圖4 腎臟中活菌數(shù)的log10CFU/g圖

2.3 腎臟病理切片HE染色 結(jié)果顯示6組小鼠均具有腎病形態(tài)特征：腎小球輕度腫脹，腎小管輕度變性腫脹，部分?jǐn)U張，間質(zhì)灶性炎癥，中性粒細(xì)胞居多，伴有灶性膿腫樣病灶形成，各組病變性質(zhì)相似，以模型組為最重，兩藥合用組最輕，其它組基本相近（圖5）。模型組為腎髓質(zhì)內(nèi)廣泛炎性病變；單用鹽酸小檗堿組腎髓質(zhì)部腎小管上皮變性壞死、脫落；單用氟康唑組腎髓質(zhì)內(nèi)有膿腫形成；合用1組腎髓質(zhì)內(nèi)有膿腫形成；合用2組腎髓質(zhì)內(nèi)有炎性病變，但未見膿腫形成；合用3組腎曲管上皮有輕微變性，但未見膿腫形成。

圖5 腎臟病理切片HE染色（10×20）

3 討 論

以編號(hào)0304103的臨床耐藥白念珠菌建立ICR小鼠系統(tǒng)性真菌感染模型，并進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，研究氟康唑、鹽酸小檗堿單用以及合用對(duì)感染白念珠菌小鼠的治療情況。給藥劑量和給藥途徑均在參考相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)后確定[5]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)主要觀察小鼠存活時(shí)間，由于真菌感染小鼠體內(nèi)真菌在腎臟的聚集較多、損傷較重，因此筆者還檢測了腎臟內(nèi)活菌數(shù)目（CFU）以及腎臟病理變化。結(jié)果顯示兩藥合用組的存活時(shí)間明顯長于氟康唑單獨(dú)治療組，且具有劑量依賴性。兩藥合用2、3組的腎臟內(nèi)活菌數(shù)目明顯低于單藥治療組，腎臟病理切片的HE染色檢查結(jié)果顯示各組病變性質(zhì)相似，但以模型組為最重，間質(zhì)灶性炎癥伴有灶性膿腫樣病灶形成；兩藥合用組最輕，未見膿腫形成。以上結(jié)果說明氟康唑合用鹽酸小檗堿后對(duì)系統(tǒng)性真菌感染小鼠具有增強(qiáng)療效的作用，以大劑量鹽酸小檗堿合用氟康唑治療效果最佳。這種療效的增強(qiáng)，一方面是由于氟康唑與鹽酸小檗堿協(xié)同抗菌作用，另一方面小檗堿對(duì)免疫的調(diào)節(jié)作用可能也增強(qiáng)了小鼠對(duì)抗真菌感染的能力。有研究報(bào)道小檗堿能夠增強(qiáng)小鼠的非特異性免疫反應(yīng)，增強(qiáng)單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的功能可能由于小檗堿自身結(jié)構(gòu)中的季銨離子減弱了異物與細(xì)胞間的靜電斥力，使異物易與吞噬細(xì)胞表面相應(yīng)受體結(jié)合而促進(jìn)吞噬作用[6，7]。

目前抗真菌藥的聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)成為臨床抗真菌治療的發(fā)展方向之一，但是現(xiàn)有的報(bào)道多局限于少數(shù)抗真菌藥物之間的聯(lián)合應(yīng)用，有關(guān)針對(duì)耐藥白念珠菌的聯(lián)合用藥報(bào)道較少，而且有些抗真菌藥物合用后反而產(chǎn)生相互拮抗的作用[8，9]，因此目前急需研究出新的安全有效的聯(lián)合用藥方案。由于臨床濫用抗生素，白念珠菌耐藥性的產(chǎn)生越來越普遍，并已經(jīng)成為臨床真菌感染治療的致命難題，本課題研究為對(duì)抗氟康唑耐藥的臨床白念珠菌提供了新思路；但其協(xié)同作用的機(jī)制仍不清楚，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究。另外體外藥敏和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床療效的相關(guān)性還是未知的，因此對(duì)于聯(lián)合用藥還需要大樣本的臨床應(yīng)用，進(jìn)行療效驗(yàn)證及其可行性研究。

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