黃芩內(nèi)生細菌的分離及抑菌研究

郭 純，許召賢，呂晶森，周小江

（湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208）

內(nèi)生菌（Plant endophyte）是指在其生活史的一定階段或全部階段生活于植物的各種組織和器官的細胞間隙或細胞內(nèi)的微生物，這些微生物有細菌、真菌、放線菌等[1-3]。植物內(nèi)生菌侵入寄主植物后，在特定的環(huán)境和生理條件下，不僅能脅迫促進寄主體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的形成和累積，而且自身也可產(chǎn)生與宿主相同或不同的生理活性物質(zhì)。因此，從植物內(nèi)生菌入手來研究道地藥材的形成具有深遠的意義[4-10]。

黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）為常用的著名的傳統(tǒng)中藥之一，是唇形科植物黃芩的干燥根，具有抗菌，消炎及抗病毒的功效[11]。目前國內(nèi)外關(guān)于黃芩的研究主要集中在植物化學成分和栽培等方面，而內(nèi)生菌的研究較少且集中在內(nèi)生真菌，其內(nèi)生細菌研究尚未見報道[12]。為此，筆者對黃芩內(nèi)生細菌進行了分離，并研究了其發(fā)酵液抗菌的效果，旨在探索黃芩與其內(nèi)生細菌的關(guān)系以及進一步尋找新的抗菌活性成分。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 子芩采自安徽亳州，經(jīng)鑒定為黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的根。

1.1.2 供試菌種 供試指示菌菌種為大腸桿菌（Escherichia coli），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），金黃色葡萄球菌（Staphylocccus aureus），均購自廣東省微生物研究所。

1.1.3 培養(yǎng)基 NA（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，pH值7.2。固體培養(yǎng)基另加2%的瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 黃芩內(nèi)生細菌的分離純化 （1）表面消毒：參考宋培勇等介紹的方法，稍做改進。將黃芩根用蒸餾水沖洗，風干表面水分，剪成小段，無菌水漂洗2次，75%酒精浸泡1min，再用0.1%氯化汞溶液浸泡10 min，轉(zhuǎn)入75%酒精中浸泡30 s，接著用無菌水漂洗3次，平放于 NA平板上，28℃培養(yǎng) 2～3 d。取最后一次漂洗液涂布NA平板作為對照。（2）內(nèi)生菌分離和純化：將NA平板上組織塊下或周緣長出的菌落或菌苔劃線稀釋分離 1～2次直到獲得純培養(yǎng)。

1.2.2 黃芩內(nèi)生細菌的形態(tài)學鑒定 從菌落特征、革蘭氏染色特征、細胞形態(tài)特征等對分離菌株進行初步鑒定。

1.2.3 黃芩內(nèi)生細菌的發(fā)酵 將純化后的單個菌落轉(zhuǎn)接到裝有30mL NA液體培養(yǎng)基的100mL錐形瓶中，在30℃，160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，作為種子培養(yǎng)液。2 d后，移取1mL的種子培養(yǎng)液接種到裝有100mL PDA液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30℃，160 r/min條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)3 d。

1.2.4 發(fā)酵液抑菌活性測定 將高溫滅菌后的濾紙片（R=8 mm）在離心得到的發(fā)酵液中浸泡，取出晾干，然后再浸泡1次，取出晾干，以加大濾紙片上有效物質(zhì)的濃度。將晾干的濾紙片放在涂有指示菌的培養(yǎng)基上，并且以無菌水和0.01 mg/mL的氨芐青霉素做對照。生化培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)2 d，觀察抑菌圈的有無以及測量抑菌圈的直徑（抑菌圈直徑=無菌圈直徑-濾紙片直徑）[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芩內(nèi)生細菌的分離

通過微生物學傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和劃線稀釋分離方法從子芩中獲得內(nèi)生細菌8株。其中既有革蘭氏陰性菌株，又有革蘭氏陽性；既有桿狀的，也有短桿狀或球狀的（表1）。

表1 黃芩8種內(nèi)生菌平板培養(yǎng)的形態(tài)學觀察結(jié)果

2.2 黃芩內(nèi)生細菌發(fā)酵液的抑菌性

8種黃芩內(nèi)生菌液體發(fā)酵后，對其進行了抑菌活性測定。結(jié)果如表2所示，7種菌的發(fā)酵液對大腸桿菌生長均有抑制作用，6種對枯草芽孢桿菌生長有抑制作用，5株對金黃色葡萄球菌生長有抑制作用。其中G8菌株發(fā)酵液對大腸桿菌抑制作用效果最好，G6菌株發(fā)酵液對枯草芽孢桿菌抑制作用效果最好。

3 結(jié)論與討論

植物內(nèi)生菌還是一個未開發(fā)的新領域，它們所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)往往是新穎的，可能具有很好的應用特性。研究表明，黃芩根中存在一定數(shù)量的內(nèi)生菌，其內(nèi)生菌對病原菌有抑菌活性。因此，利用黃芩內(nèi)生菌篩選高效、新穎、低毒的抗菌活性物質(zhì)存在很大的可能性。

表2 黃芩8種內(nèi)生細菌發(fā)酵液抑菌效果

試驗通過微生物學傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和劃線稀釋分離方法從黃芩根中分離出內(nèi)生細菌8株。以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌為供試菌，對8種黃芩內(nèi)生菌液體發(fā)酵并進行了抑菌活性測定，結(jié)果表明，黃芩內(nèi)生細菌對3種供試菌有一定的抑菌活性。

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