COPD患者誘導痰中TNF-α、IL-6表達水平的臨床研究

蔣 萍 黃樹紅 陳淑敏 王桂英

（山東省陽信縣人民醫院，山東 陽信 251800）

慢性阻塞性肺疾病 （COPD）是一種以氣流受限為特征的疾病，研究證實氣道炎癥尤其是小氣道炎癥是COPD的主要病變和發病的主要原因，腫瘤壞死因子α （TNF-α）在氣道局部炎癥中起重要作用。但到目前為止，誘發和控制慢性阻塞性肺疾病急性加重期（AECOPD）炎癥的機制尚未清楚，可能與氣道內炎性因子與抗炎介質的失衡，或內源性抗炎機制缺陷有關。氣道局部炎癥機制的研究方法有多種，誘導痰技術由于安全可靠等原因，更適合進行氣道局部炎癥機制的研究。為此，我們通過測定COPD急性加重期患者誘導痰液中TNF-α和IL-6的水平，以探討其在COPD急性加重過程中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2009年3月至2010年12月我院呼吸科住院的COPD急性加重期患者共38例，男25例，女13例；年齡50～85歲；病程5～40年。COPD緩解期患者38例，男28例，女10例；年齡55～86歲；病程8～35年。所有病例均符合2007年中華醫學會呼吸病學分會制訂的《慢性阻塞性肺疾病診治指南》的標準[1]，并在入選前4周內未吸入糖皮質激素，3個月內未全身使用糖皮質激素治療，X線證實無肺炎者，近4周內沒有用過抗生素和呼吸系統之外的細菌感染者。健康對照組28例，入選標準：非吸煙者，無呼吸道癥狀及心肺等疾患，入選前4周內無呼吸道感染史。排除標準：除外合并支氣管哮喘、支氣管擴張癥等其他慢性呼吸系統疾病，除外合并其他全身炎癥性疾病、過敏性疾病、腫瘤性疾病、系統性免疫功能異常等可能引起補體活化的疾病。全部研究對象均獲得知情同意。

1.2 方法

①樣本采集：開水或生理鹽水徹底漱口、擤鼻涕、清理口腔和鼻腔分泌物，吸入沙丁胺醇200μg，20min后霧化吸人3%無菌高滲氯化鈉溶液20～30min，留痰于無菌干燥盛痰杯中，如受試者在霧化吸人過程中出現喘息、惡心嘔吐、呼吸困難及其他難以忍受的癥狀則隨時終止試驗，并給予沙丁胺醇200μg吸入，觀察至癥狀緩解。②誘導痰的采集、處理和質量控制：參照文獻[2]的方法進行。整個過程盡量在2h內完。取無唾液成份的痰液放人離心試管中，加4倍體積的1 g/L二硫蘇糖醇孵育，螺旋振蕩15min，加入與二硫蘇糖醇等體積的Hank's液，再置于37℃恒溫水浴振蕩箱振蕩15min使其均勻，3500r/min（r=15cm），離心20 min，沉淀細胞作痰液質量檢查，上清液于-80℃凍存待測。沉淀細胞用Hank'液懸浮，在血細胞儀上計數細胞總數，用臺盼藍染色排除法測定細胞存活率。調節細胞懸浮密度至1×106，將75μL懸浮液置于細胞離心機450 r/min離心6 min，細胞沉渣涂片，風干，吉姆薩染色，每張涂片計數400個細胞。分類計數，鱗狀上皮細胞＜20%，細胞存活率＞50%提示痰來源于下呼吸道，為合格標本，可進行有關生化測定。③測定TNF-α和IL-6：采用ELISA法測定痰上清中TNF-α和IL-6 （美國BD公司生產上海西唐生物科技有限公司提供試劑盒）嚴格按照試劑說明書操作。④肺功能檢測：所有觀察對象均使用肺功能儀測定FEV1，FVC，并計算出第一秒用力呼氣流量占預計值百分數（FEV1%pre）和FEV/FVC%等。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組間肺功能指標比較

急性加重組、穩定期組FEV1%p re較健康對照組明顯降低（P＜0.01）；急性加重組、穩定期組FEV1/FVC%、MMEF%pre較健康對照組明顯降低（P＜0.01）；急性加重組、穩定期組PEF%pre較健康對照組明顯降低（P＜0.01）；急性加重組、穩定期組RV%pre較健康對照組明顯升高（P＜0.01）。見表1。

2.2 各組間誘導痰上清液中IL-6、TNF-α濃度比較

表1 各組間肺功能指標比較

急性加重組、穩定期組患者誘導痰上清液中TNF-α、IL-6濃度較健康對照組明顯升高（P＜0.05）；急性加重組患者誘導痰上清液中

TNF-α、IL-6濃度較穩定期組明顯升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組間誘導痰上清液中TNF-α、IL-6濃度比較

2.3 誘導痰上清液中IL-6濃度與肺功能氣流阻塞指標FEFV1%pre、

FEV1/FVC%呈負相關（r=-0.689，P＜0.01；r=-0.673，P＜0.01）；

3 討 論

COPD是一種具有氣流受限特征的疾病，氣流受限不完全可逆，呈進行性發展，與肺部對有害氣體或有害顆粒的異常炎癥反應有關。COPD是由多種炎性細胞及其所釋放的多種炎性遞質、細胞因子參與的復雜的慢性氣道炎癥。COPD急性發作時，病毒或細菌所含的某些抗原成分或代謝產物如脂多糖、內毒素可以激活局部肺泡巨噬細胞產生 TNF-α等炎性因子[3]。這些炎性因子繼而又可促進肺泡巨噬細胞和支氣管上皮細胞產生 IL-6、IL-8。由于局部產生的細胞因子吸收入血以及內毒素引起體內單核-巨噬細胞廣泛的激活，導致血中 TNF-α升高。學者多次研究發現 COPD 急性發作期患者血中IL-6、IL-8水平與TNF-α水平呈明顯正相關。急性感染時，通過巨噬細胞激活使TNF-α的產生增多，而TNF-α可促進炎癥細胞粘附游走和浸潤，迅速引起肺組織損傷。表明TNF-α是COPD病情加重的一個重要指標，也是COPD嚴重程度的重要標志。

IL-6是一種主要由活化的單核細胞、巨噬細胞、T和B淋巴細胞、內皮細胞及成纖維細胞等分泌的具有多種生物學功能的細胞因子，因分子結構中保留了2個半胱氨酸殘基而表現出化學趨化作用，參與COPD的氣道炎癥和氣道重塑[4]。

TNF-α是具有廣泛生物活性的炎性因子，參與了炎癥過程中中性粒細胞的聚集和活化，使 COPD患者氣道黏膜中大量的中性粒細胞浸潤。研究發現COPD患者誘導痰和血漿中 TNF-α水平均較非 COPD患者明顯增高。目前為止，COPD炎癥機制尚未明確，可能與炎性因子和抗炎遞質的失衡有關[5]。隨著局部炎癥的好轉，患者癥狀改善，病情趨于緩解。

本實驗結果顯示：COPD急性發作期TNF-α、IL-6表達水平與FEV1%pre值呈直線負相關，提示這些指標在炎性反應的發展過程中均發揮了作用。

[1] 中華醫學會呼吸病學分會慢性阻塞性肺疾病學組.慢性阻塞性肺疾病診治指南(2007年修訂版)[J].中華結核和呼吸雜志,2007,30(1):8-17.

[2] 曾勉,劉凌云,張式鴻,等.各期慢性阻塞性肺疾病患者誘導痰細胞成分與肺功能的關系[J].中山大學學報:醫學科學版,2007,28(4):422-425.

[3] Hacker T,Holloway,Holqate ST,et al.Dynamics of pro-inf l ammatory and anti-inf l ammatory cytoline release during acute inf l ammation in cllrom c obstructive pulmonary disease: an ex vivo study[J].Respir Res,2008,9(1):472.

[4] DE BOER W I. Cytokines and therapy in COPD[J]. Chest,2002,121(2):209S-218S.

[5] 王卓,夏國光,姚婉貞.慢性阻塞性肺疾病急性加重期病原學研究[J].中國全科醫學,2009,12(11):1942.