三種原理苦參結腸靶向微丸在大鼠體內轉運及釋藥性能的對比研究

謝興亮，韓麗，楊明

苦參性苦寒，歸心、肺、腎、大腸經，具有清熱燥濕、祛風殺蟲的功效，主治濕熱下注大腸所致瀉痢、腸風便血等，臨床用其灌腸治療結腸炎[1]，療效肯定。現代研究表明，苦參所含苦參堿、氧化苦參堿等成分，具有抑制炎癥介質釋放、降低毛細血管通透性、抑制肉芽組織增生、保護胃腸道黏膜、止瀉、免疫抑制等多種藥理作用[2]，為其治療結腸炎的主要藥效成分，兩者口服吸收后在結腸分布很少，其藥理效應不與血藥濃度直接相關[3-4]，而與效應室——結腸的藥物濃度呈良好相關性，因此采用結腸定位給藥，可顯著提高結腸病灶部位苦參成分的濃度從而充分發揮其藥效。

根據結腸靶向給藥系統的研究進展，我們在前期研究中以苦參堿、氧化苦參堿為原料，設計、制備了 3 種原理結腸靶向微丸：① pH 敏感單層型。以 Eudragit S100 為成膜劑設計單層包衣，利用其可在 pH 7.0 以上的回腸末段環境中溶解的特性從而實現結腸定位釋藥。② pH 敏感雙層型。外層以Eudragit L100 為包衣對抗胃液的溶蝕，保護微丸抵達小腸，進入小腸后外層 Eudragit L100 即溶解，此時內層 Eudragit E100 包衣暴露于小腸的弱堿性環境中，由于 Eudragit E100 只溶于酸性環境因而可將藥物成功轉運至結腸；有研究表明，潰瘍性結腸炎（UC）患者的升結腸呈酸性環境，檢測其最低pH 值為2.3，顯著低于小腸 pH 值[5]，因此，Eudragit E100 包衣可在 UC 患者酸性的結腸環境中完全溶解從而釋放出藥物。③ pH-酶觸發雙控型。內層以 Eudragit E100 為隔離衣；中間層以殼聚糖為包衣，殼聚糖可被結腸菌群分泌的糖苷酶特異性降解；外層以 Eudragit L100 為包衣，以對抗胃液對殼聚糖膜的侵蝕。3 種方案的靶向微丸各有其設計依據，前期我們已對其體外釋藥性能進行了對比研究[6]，在此基礎上，本研究進一步開展了 3 種靶向微丸在大鼠體內的轉運及釋藥性能研究，以探討其體內靶向性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 pH 敏感單層型（I 型）、pH敏感雙層型（II 型）、pH-酶觸發雙控型（III 型）苦參結腸靶向微丸以及苦參丸心均為江西中醫學院現代中藥制劑教育部重點實驗室自制，其中苦參堿與氧化苦參堿總含量依次為145、130、96、189 mg/g；苦參堿對照品（批號 110805-200804）和氧化苦參堿對照品（批號 110780-200806）均購自中國藥品生物制品檢定所；乙腈購自美國如意公司；其余試劑均為國產分析純。C-18 色譜分析柱（250mm×0.46mm）購自北京迪馬科技有限公司；高效液相色譜儀（P680 HPLC Pump 泵、UVD170U紫外檢測器）為美國戴安（DIONEX）公司產品。

1.1.2 實驗動物 健康 SD 大鼠 108 只，雄性，7～8 周齡，體重 220～250 g，由成都中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（川）2008-11。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥方法 取 3 種苦參結腸靶向微丸及苦參丸心各約 150 mg，精密稱定重量，并對微丸計數（以 N總表示）。按給藥不同將 SD 大鼠隨機分為4 組：I、II、III 型苦參結腸靶向微丸組和苦參丸心組，每組每時間點各 3 只。

大鼠禁食不禁水 12 h 后，采用乙醚吸入麻醉，通過胃插管（內徑 2.0mm、外徑 3.0mm）將各微丸完整送入體內，再按 5 ml/只灌服蒸餾水。苦參丸心組分別于給藥后 0.5、1、2 h，3 種苦參結腸靶向微丸組分別于給藥后 1、2、3、4、6、8、10、12、16、20、24 h 等時間點處死大鼠，打開腹腔，分別取胃、小腸（幽門至回盲部）、結腸（回盲部至肛門）各段消化道，備用。

1.2.2 微丸在體內的轉運分布 用手術剪縱向剖開大鼠胃、小腸、結腸，在鑷子輔助下，觀察各段消化道中微丸的外觀性狀，并分別對各段內微丸計數（以 NX表示）。按照“分布率（%）= NX/N總×100%”，計算給藥后不同時間點各類微丸在大鼠體內各段消化道的分布率。

1.2.3 HPLC 法含量測定考察

⑴HPLC 色譜條件：DiamonsiL C-18 色譜分析柱，流動相為5∶95 配比的乙腈-pH3.0 磷酸緩沖液（水∶三乙胺∶磷酸 = 500∶1∶1），流速為1 ml/min，柱溫 40℃，檢測波長為205 nm，靈敏度 0.01 AUFS。于此條件下，吸取苦參堿、氧化苦參堿對照品溶液、苦參微丸供試品溶液各 10 μl，所得色譜圖顯示待測成分色譜峰分離良好（圖1）。

圖1 HPLC 色譜圖（A：苦參堿對照品；B：氧化苦參堿對照品；C：微丸）Figure 1 The HPLC chromatogram (A: The reference substance of matrine; B: The reference substance of oxymatrine;C: Pellets)

⑵線性范圍考察：苦參堿對照品溶液在進樣量0.067～0.402 μg 范圍內，回歸方程為A= 525.78 C+ 3.324，r= 0.9994，與峰面積線性關系良好；氧化苦參堿對照品溶液在進樣量 0.1348～0.8088 μg 范圍內，回歸方程為A= 59.588 C － 2.2951，r=0.9993，與峰面積線性關系良好。

⑶擬定的苦參微丸供試品溶液制備方法：用鑷子小心取出大鼠胃腸道內微丸，置濾紙上滾動吸去表面黏附物，研細，精密加入甲醇 25 ml，洗滌并轉移至具塞三角瓶中，稱量，超聲提取（50 kHz，250 W）30min，冷卻，稱量，加甲醇補足損失，搖勻，精密吸取 1 ml 上清液，置 10 ml 量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，0.45 μm 濾過即得。

此外，精密度、供試品溶液穩定性、重復性、加樣回收率等實驗考察結果均符合含量測定要求。

1.2.4 微丸體內累積釋放度及定位釋藥性能的評價 采用 HPLC 法測定不同時間點大鼠消化道內微丸中苦參堿、氧化苦參堿的殘留總量（以 M剩表示），根據給藥前微丸中苦參堿、氧化苦參堿的總含量（以 M總表示），按照“R（%）=（M總－M剩）/ M總×100%”，計算在給藥后不同時間點各微丸在大鼠體內的累積釋放度（R），并以時間為橫坐標、累積釋放度為縱坐標繪制釋藥曲線。

此外，根據各微丸在胃與小腸的累積釋放度（R胃+小腸）以及結腸累積釋放度（R結腸），按照“Ind=（R結腸－ R胃+小腸）/ R胃+小腸”，計算定位釋藥指數（Ind），以評價各微丸的定位釋藥性能。

2 結果

2.1 微丸的體內轉運分布

苦參丸心在給藥后 0.5～2 h 均完全停留于大鼠胃部；給藥后 0.5 h 丸心完整，但明顯溶脹，捏之易碎；給藥后 1 h 丸心仍然完整，溶脹更為明顯，極易碎裂；給藥后 2 h 大部分丸心已破裂，且難以與胃內容物分離。3 種靶向微丸給藥后，除在胃部停留時間過長（6 h 以上）的少量微丸略有輕微溶脹外，其余時間點微丸在胃、小腸段內外觀均未見明顯變化，能完整地進入結腸；在給藥后 10～12 h結腸段微丸有明顯溶脹、破碎現象，給藥后 20～24 h 基本破碎完全。

統計計算 3 種靶向微丸給藥后不同時間點在各段消化道的分布率，結果顯示：①胃部：3 種靶向微丸胃排空均呈連續性，I 型與 II 型排出 50%約需 4 h，完全排出約需 10～12 h，兩者無明顯差異；而 III 型微丸排出 50%約需 8 h，明顯慢于 I、II 型。②小腸段：在所有時間點，I、II 型微丸僅在給藥后 2～4 h，III 型微丸在給藥后 3～8 h 可檢測到少量微丸分布，分布率最高僅為33.3%，表明微丸在小腸段不會長時間滯留，轉運較快。③結腸段：3 種靶向微丸均在給藥后 3～4 h 有少量抵達結腸；I、II 型微丸在給藥后 4 h 胃與小腸段的總分布率依次為81.6%、61.6%，而在給藥后 8 h 結腸段分布率依次為78.3%、91.7%；III 型微丸在給藥后 8 h 胃與小腸段的總分布率仍為67.2%，在給藥后 10 h 結腸段分布率為83.3%，與 I、II 型微丸相比，抵達結腸時間明顯延遲（表1～3）。

表1 給藥后不同時間 I 型微丸在大鼠消化道內的分布（%，n = 3）Table 1 The distribution of model I pellets in rats alimentary canal after administration at different times (%, n = 3)

表2 給藥后不同時間 II 型微丸在大鼠消化道內的分布（%，n = 3）Table 2 The distribution of model II pellets in rats alimentary canal after administration at different times (%, n = 3)

表3 給藥后不同時間 III 型微丸在大鼠消化道內的分布（%，n = 3）Table 3 The distribution of model III pellets in rats alimentary canal after administration at different times (%, n = 3)

2.2 微丸體內累積釋放度

HPLC 法測定不同時間點大鼠消化道內各微丸中苦參堿、氧化苦參堿的殘留總量，計算各微丸的累積釋放度，并繪制釋藥曲線，結果顯示：①苦參丸心在給藥后 0.5 h 累積釋放度達 91.3%，基本釋藥完全；與苦參丸心相比，3 種靶向微丸均具有明顯的遲釋效應。② I、II 型微丸在給藥后 8 h 累積釋放度分別為17.4%、11.8%，III 型微丸在給藥后 10 h 累積釋放度為34.5%，因此時絕大部分微丸已被轉運至結腸，3 種靶向微丸在胃與小腸段累積釋放度由高至低依次為III 型 ＞ I 型 ＞ II 型。③ I、II、III 型微丸在給藥后 24 h 累積釋放度分別為98.9 %、97.7%、91.7%，基本釋藥完全，3 種靶向微丸在結腸段累積釋放度由高至低依次為I 型 ＞ II 型 ＞ III 型（表4，圖2）。

表4 給藥后不同時間3種靶向微丸的體內累積釋放度（%，n = 3）Table 4 The accumulated drug release rate of three kinds of target pellets in vivo after administration at different times (%, n = 3)

圖2 3 種靶向微丸的體內釋藥曲線Figure 2 Drug release curves of three kinds of target pellets in vivo

2.3 微丸體內定位釋藥性能

選擇 I、II 型微丸在給藥后 8 h 累積釋放度R胃+小腸值，III 型微丸在給藥 10 h 后累積釋放度R胃+小腸值，3 種靶向微丸在給藥后 24 h 累積釋放度 R結腸值，分別計算 I、II、III 型微丸的體內定位釋藥指數（Ind），結果分別為4.7、7.3、1.7，據此推斷其結腸定位釋藥性能由高至低依次為II 型＞ I 型 ＞ III 型。

3 討論

在胃腸道中的轉運是影響口服結腸靶向給藥系統（OCTDS）靶向性及藥效的關鍵因素之一。3 種苦參結腸靶向微丸在大鼠體內的胃排空時間明顯長于通常認可的 2 h，部分微丸可在胃部停留達 10 h，這是否由人與大鼠之間種屬差異所致，仍有待深入研究。同時，在小腸段各時間點僅檢測到少量微丸分布，提示其一旦進入小腸后，即可被迅速且穩定地轉運至結腸，不存在異常滯留現象，與當前對小腸轉運的認識一致。III 型微丸的胃排空速率明顯慢于 I 型、II 型微丸，導致其抵達結腸時間比 I 型、II 型微丸延遲 2 h 左右，這可能是 III 型微丸在胃與小腸累積釋放度偏高、定位釋藥性能偏低的原因之一，提示 OCTDS 制劑的胃排空速率及其抗胃液侵蝕性能是需要重點關注的因素。

由于受小腸吸收、腸道代謝、檢測方法等影響，直接測定各段消化道內容物中藥物濃度，以評價微丸在體內累積釋藥性能可能存在較大誤差。本研究根據給藥后不同時間點微丸在各段消化道內的分布情況，測定不同時間點各段消化道內微丸中殘留藥物含量，從而間接計算累積釋放度，不僅易于檢測，而且可排除體內因素干擾，為判斷微丸在各段消化道的釋放情況提供了較為可靠的依據，但也存在難以直接判斷微丸在某一具體部位釋藥量的問題。此外，3 種靶向微丸的定位釋藥指數（Ind）均根據其各自體內轉運、分布情況，選擇與真實情況最為接近的實驗數據計算而得，雖然這些數據并非微丸在胃、小腸、結腸釋藥量的真實數值，但對于分析 3 種靶向微丸的結腸定位釋藥性能仍具有一定指導意義。

[1]Enhe BT.The Sophora flavescens powder including fifteen kinds of Chinese medicinal materialscrue chronic ulcerative clotis.J Med Pharm Chinminor, 2010, 16(3):19.(in Chinese)恩和巴圖.苦參-15味散灌腸治療慢性潰瘍性結腸炎.中國民族醫藥雜志, 2010, 16(3):19.

[2]Wang JX, Wang GJ.The pharmacological action and clinical application of matrine and oxymatrine.Chin Hepatol, 2000, 5(2):116-117.(in Chinese)王俊學, 王國俊.苦參堿及氧化苦參堿的藥理作用及臨床應用.肝臟, 2000, 5(2):116-117.

[3]Wang XH, Huang SK.Pharmacokinetics and pharmacodynamics of marine and oxymatrine.Acta Pharmaeeutiea Sinica, 1992, 27(8):572-576.(in Chinese)王曉紅, 黃圣凱.苦參堿及氧化苦參堿的藥代動力學與藥效動力學.藥學學報, 1992, 27(8):572-576.

[4]Wang SJ, Wang GJ, Li XT, et al.Absorption mechanism and absorption site of oxymatrine in rats.Chin J Clin Pharmacol Therapeutics, 2005, 10(12):1326-1329.(in Chinese)王素軍, 王廣基, 李曉天, 等.氧化苦參堿大鼠腸道吸收機理及吸收部位的研究.中國臨床藥理學與治療學, 2005, 10(12):1326-1329.

[5]Sasaki Y, Hada R, Nakajima H, et al.Improved localizing method of radiopill in measurement of entire gastrointestinal pH profiles:Colonic luminal pH in normal subjects and patients with Crohn's disease.Am J Gastroenterol, 1997, 92(1):114-118.

[6]Xie XL.The study of drug delivery system of YuChang ning.Chengdu: Chengdu University of TCM, 2009:42-68.(in Chinese)謝興亮.愈腸寧復方釋藥制劑的研究.成都: 成都中醫藥大學,2009:42-68.