東鄉(xiāng)縣城污水中耐熱大腸菌群的耐藥性檢測與分析

李仁道，何金德

(1、江西省東鄉(xiāng)縣疾病預(yù)防控制中心，江西 東鄉(xiāng) 331800；2、江西省東鄉(xiāng)縣環(huán)境監(jiān)測站，江西 東鄉(xiāng) 331800)

抗生素在人和動物中的濫用所導(dǎo)致的微生物抗生素耐藥性在國內(nèi)外臨床醫(yī)學(xué)和畜牧獸醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域一直受到高度重視，而其對生態(tài)環(huán)境所造成的負(fù)面效應(yīng)還鮮為人知。隨著抗生素的大量使用，部分沒有被代謝掉的抗生素會隨人和動物的排泄作用而不斷進(jìn)入環(huán)境，從而使得環(huán)境中的微生物長期處于低濃度抗生素的訓(xùn)化狀態(tài)中，經(jīng)過一定時間后也有可能逐漸產(chǎn)生耐藥性。微生物耐藥性產(chǎn)生的機(jī)理之一就是耐藥基因的形成，比如抗性基粒。一旦產(chǎn)生這種基因，就有可能會引起更廣泛的傳播。歐盟各國學(xué)者最近的研究結(jié)果表明，環(huán)境中抗生素微量污染及抗生素耐藥性細(xì)菌的存在和傳播不容忽視[1，2]。

水環(huán)境中耐熱大腸菌群的抗生素耐藥性具有尤其重要的衛(wèi)生學(xué)意義：水中耐藥菌及其耐藥因子能通過飲水或游泳等途徑進(jìn)入人體腸道進(jìn)而將耐藥性轉(zhuǎn)移腸道寄居的細(xì)菌獲得性耐藥[3]。

進(jìn)入污水處理廠的污水主要是居民的生活污水，也包含有醫(yī)院排放的污水，抗生素殘留的可能性很大。本研究從江西省東鄉(xiāng)縣污水處理廠二沉池中采集水樣分離出耐熱大腸群菌，并采用藥敏試紙擴(kuò)散法選用了15種目前臨床上常用的抗生素，進(jìn)行了抗藥性的初步研究。

1 材料與方法

1.1 水樣 東鄉(xiāng)縣污水處理廠始建于2009年，是一座現(xiàn)代化城市污水集中處理廠，污水主要來自縣城區(qū)域的居民生活污水及兩家縣級醫(yī)院排放的污水。平均日處理污水2.5～3萬m3。本研究于2011年4月采取污水處理廠的二沉池的水樣，用經(jīng)滅菌的玻璃瓶裝回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 耐熱大腸菌群的分離 耐熱大腸菌群又稱糞大腸菌群，是一類通常寄居于人和溫血動物腸道,在44.5℃生長良好并發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌，主要包括大腸埃希桿菌(E.coli)、克雷伯菌屬(Klebsiella)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷菌屬(Serratia)和檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)。在受到糞便污染的水體中，此菌群與腸道致病菌具有相似的適應(yīng)性和敏感性，存在時間大致相同，因此在水質(zhì)監(jiān)測中被用作糞便污染的優(yōu)良指示菌[4]。

本實(shí)驗(yàn)參照美國《水和廢水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法》[5]中的濾膜法在4h內(nèi)對水樣中的耐熱大腸菌群進(jìn)行檢測分離。10ml水樣加入90ml無菌生理鹽水中充分混勻。用口徑為47mm、孔徑0.45μl的微孔濾膜過濾。濾膜細(xì)菌截留面向上，以滾動方式置于經(jīng)改良的m-FC平板(以甲基藍(lán)替換苯胺藍(lán))上，排除光滑面與平板表面的氣泡。于37℃進(jìn)行5h復(fù)蘇培養(yǎng)后轉(zhuǎn)至44.5℃培養(yǎng)19h。

對濾膜上典型藍(lán)色菌落數(shù)為20～60的平板上菌落進(jìn)行計數(shù),計算耐熱大腸菌群平均密度。用無菌接種針挑取各類形態(tài)的藍(lán)色菌落50個，用LB培養(yǎng)基平板劃線接種純化，純化菌株接種于半固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24小時后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 耐藥性測定 采用紙片擴(kuò)散法 (Kirby-Bauer法)[6]，按照臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)的抗微生物藥物敏感試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[7]判斷結(jié)果。

1.4 質(zhì)控菌株 大腸埃希菌ATCC25922。

2 結(jié)果

2.1 耐熱大腸菌群檢測結(jié)果 污水耐熱大腸菌群平均密度為為 9.2×102CFU/100ml。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 50株耐熱大腸菌群除對對亞胺培南全部敏感外，對其余14種抗生素均表現(xiàn)了不同程度的耐藥，其中對氨芐西林耐藥率最高為78%。具體耐藥情況見表1。

3 討論

表2 耐熱大腸菌群對常用抗生素藥物的耐藥率

本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，污水環(huán)境中耐熱大腸菌群對常用抗生素存在一定程度的耐藥性。與劉小云等通過水環(huán)境中耐熱大腸菌群對10種常用抗生素的藥物敏感性試驗(yàn)，表明水環(huán)境微生耐藥性普遍存在的結(jié)論基本相符[8]。

在本實(shí)驗(yàn)中，分離出的耐熱大腸菌群的耐藥率由高到低分別為氨芐西林、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、頭孢他啶、左氧氟沙星、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢噻吩、哌拉西林、阿米卡星、頭孢西丁、慶大霉素、阿莫西林/克拉維酸、氨曲南、亞胺培南，其中β-內(nèi)酰胺類(包括青霉素類、頭孢菌素類)的氨芐西林耐藥率78%、頭孢他啶耐藥率為32%、頭孢曲松耐藥率28%、頭孢噻肟耐藥率26%、頭孢噻吩耐藥率為24%、頭孢西丁耐藥率20%、阿莫西林/克拉維酸17%。與常曉松等對醫(yī)院污水污染水環(huán)境中耐熱大腸菌群氨芐西林耐藥率80.0%、頭孢噻肟耐藥率25.0﹪實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致[9]。青霉素類、頭孢菌素類是目前臨床應(yīng)用最為廣泛的抗菌素，其在臨床的大量應(yīng)用導(dǎo)致針對此類抗菌素的耐藥率升高，并占主導(dǎo)地位[9]。水環(huán)境中的耐熱大腸菌群對青霉素類抗菌素產(chǎn)生這么高的耐藥率，說明青霉素類抗菌素的濫用已經(jīng)非常嚴(yán)重，不僅增加了臨床耐藥性傳播的機(jī)率，而且導(dǎo)致了排放水環(huán)境中相應(yīng)抗菌素耐藥率的顯著升高。水環(huán)境微生物耐藥性形成的原因可能有：人和動物體內(nèi)耐藥菌及耐藥因子向水環(huán)境的擴(kuò)散，水環(huán)境中低濃度的抗生素對菌群產(chǎn)生的耐藥性選擇壓力[2]。雖然其機(jī)機(jī)制并未確定，但水環(huán)境微生物耐藥極有可能是公共衛(wèi)生和生態(tài)環(huán)境的一大隱患。耐藥微生物及耐藥因子可經(jīng)多途徑侵入人體，將耐藥性傳遞給體內(nèi)致病菌，加大臨床中感染性疾病的治療難度[10-12]。

耐藥性是微生物對抗菌藥物的相對抗性，是細(xì)菌等微生物受到抗生素的選擇性壓力的反應(yīng)，是微生物進(jìn)化過程的自然規(guī)律，也是微生物耐藥基因長期進(jìn)化的必然結(jié)果。由于抗生藥物殺死了敏感菌群，而對耐藥菌的存活和繁殖無效，所以耐藥性是過度使用和濫用抗菌藥的必然后果。因此，人們應(yīng)該嚴(yán)格控制抗生素的預(yù)防使用和非醫(yī)療中農(nóng)、林、牧、副、漁以及飼料的抗生素使用，醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)積極加強(qiáng)耐藥監(jiān)測，合理、規(guī)范選用抗菌藥物，才能控制耐藥菌株的出現(xiàn)與傳播。

[1]Reinthaler FF,Posch J,Feierl G.Antibiotic resistance of E.coli in sewage and sludge[J].Water Research,2003,37:1685.

[2] Kummerer K. Resistance in the environment[J]. J Antimicrob Chemother,2004,54:311-320.

[3]Malakoff D.Microbiologists on the trail of polluting bacteria[J].Science,2002,295(29):2352-2353.

[4]Federal Provincial Territorial Committee on Drinking Water.Guidelines for Canadian Drinking Water Quality:Supporting Documentaion[S].Ottawa:Health Canada,2002:4-5.

[5]American Public Health Association.Standard methods for the examination of water and wastewater 20th ed[M].Washington D.C.:American public Health Association,1999:9221-9225.

[6]倪語星,尚 紅.臨床微生物學(xué)與檢驗(yàn)[J].第4版,北京:人民衛(wèi)生出版社,2007:58-60.

[7]CLSI.M100-S16 Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;sixteenth information supplement[S].Wayne,Pennsylvania,19087-1898 USA,2006.

[8]劉小云,舒為群,邱志群,等.水環(huán)境中耐熱大腸菌群的抗生素耐藥性與質(zhì)粒譜研究[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2006,12(1):118-121.

[9]常曉松,舒為群,趙 清,等.醫(yī)院污水污染水環(huán)境中耐熱大腸菌群耐藥規(guī)律研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2007,17(1):29-31.

[10]Radu S,Hassan Z,Radu S,et al.Characterization of Vibrio vulnificus isolated from cockles (Anadara granosa): antimicrobial resistance, plasmid profiles and random amplification of polymorphic DNA analysis[J].FEMS Microbiol Lett,1998,165:139-143.

[11]Stephanie JD.How antibiotics can make us sick:the less obvious adverse effects of antimicrobial chemotherapy[J].Lancet Infectious Dis,2004,4:611-619.

[12]Ferber D.Livestock feed ban preserves drugs＇power[J].Science,2002,295(5552):27-28.