乙肝五項指標與熒光定量PCR檢測血清HBV-DNA含量聯合運用

呂世琪，張金良，閆 奇

(安徽省阜陽市第五人民醫(yī)院檢驗科，安徽 阜陽 236037)

目前臨床常用ELISA法進行乙肝五項的檢測和用熒光定量PCR法進行HBV-DNA的定量檢測來判斷HBV病毒的感染或復制情況。我們應用熒光定量PCR技術對450份血清標本在一周內進行HBV-DNA的檢測，并采用ELISA法進行對照檢測，結果分析如下。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 450例患者血清均來自阜陽市第五人民醫(yī)院2011年1月至2011年6月門診及住院病人 ，其中男性323例，女性127例，年齡10～70歲。按乙肝五項不同模式，將HBsAg(+)/HBeAg(+)/HB-cAb(+)為第一組，HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)為第二組，HBsAg(+)/HBcAb(+)為第三組，HBsAb(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)為第四組，HBcAb(+)為第五組，HBsAg(-)/HBsAb(-)/HBeAg(-)/HBeAb(-)/HBcAb(-)，乙肝五項全陰為第六組。

1.2 實驗方法

1.2.1 HBV-DNA定量 分析，FQ-PCR檢測HBVDNA試劑盒為中山大學達安基因股份有限公司，測定儀器 為中山大學達安基因股份有限公司的DA7600熒光定量PCR儀。 嚴格按試劑盒說明進行操作，采用常規(guī)的高溫裂解法，從血清中提取HBV-DNA，同時做陰性、臨界陽性、強陽性質控品。標準參照品均由試劑盒配置，HBV陽性定量參考品：1.0×104IU/ml/管、1.0×105IU/ml/管、1.0×106IU/ml/管、1.0×107IU/ml/管，取上清液 2μl加入 FQ-PCR 反應管，按下列條件進行擴增，93℃ 2min，然后按93℃45s～55℃ 60s 10 個循環(huán)，93℃ 30s～55℃ 45s 30 個循環(huán)。反應結果由儀器自動分析，直接由電腦得出血清標本 的乙肝病毒拷貝數。正常參考值為＜1.00×103拷貝/ml。

1.2.2 乙肝五項物采用ELISA法測定，試劑盒購自上海榮盛生物技術公司。操作嚴格按試劑盒說明書進行。

2 結果

乙肝五項不同組合狀態(tài)血清HBV-DNA含量比較結果顯示，第一組患者血清HBV-DNA陽性率為 94.9%，HBV-DNA平均含量為 4.51×107copies/ml，第二組患者血清HBV-DNA陽性率為64%，平均含量為2.42×105copies/ml，第三組患者HBV-DNA陽性率為58%，平均含量為4.25×104copies/ml，第四組HBV-DNA陽性率為5%，平均含量為5.31×103copies/ml，第五組HBV-DNA陽性率為1.2%，平均含量為1.35×103copies/ml，第六組HBV-DNA陽性率為1.1%,平均含量為8.37×103copies/ml，見表1。

表1 各組HBV-DNA陽性率及平均含量

從上表可以看出第一組與第二組第三組HBVDNA陽性率及HBV-DNA平均含量有明顯差異，第四組有一例陽性患者，當時ALT：1280U/L，診斷為重性乙型肝炎，半月后復查HBV-DNA陰性，第六組一例陽性患者反復ALT升高100～180U/L，經肝細胞穿刺，原位雜交HBsAg(+)，病理診斷為乙肝。

3 討論

3.1 FQ-PCR法是實時在線檢測PCR反應過程中的熒光信號變化，避免了PCR平臺效應的干擾。而且是閉管檢測，無需電泳等后處理過程，從而避免了污染，減少了假陽性的可能。本實驗結果第一組156乙肝標本，其中148例HBV-DNA陽性，陽性率達94.9%(148/156)，第二組75例乙肝標本，其中48例HBV-DNA陽性，陽性率達64%(48/75)第六組89例乙肝五項全部陰性的標本，HBV-DNA只有一例陽性。所以該法具有高靈敏性、高特異性及高精確性。ELISA法檢測乙肝五項是臨床診斷HBV感染的傳統手段，但它檢測的是人體對HBV的免疫反應狀態(tài)，不能直接反映血清中的病毒含量。而HBV的復制水平、和治療恢復情況等則可通過檢測血清中HBV-DNA含量準確反映出來。

3.2 本研究結果顯示第一組(大三陽)標本陽性率為94.9%，HBV-DNA平均含量高，說明乙肝病毒傳染性強，復制高。

3.3 本實驗中75例第二組 (小三陽)標本陽性率達64%(48/75)，HBV-DNA 含量達 2.42×105拷貝/ml，可能是由于這種病人是長期的乙肝病毒攜帶者，HBV在體內不斷復制，持續(xù)遭受機體免疫力的攻擊，導致HBV病毒復制減低，或者另一種情況是HBV前c區(qū)的變異[1]，影響HBeAg的表達。

3.4 1 2例第三組血清中HBsAg陽性，HBeAg轉陰，HBcAb的出現說明病毒復制減低。

3.5 2 0例第四組血清陽性 率為5%(1/20)，HBVDNA含量為5.31×l03拷貝/ml，一般認為這類病人應是進人感染恢復期，少數病例仍能檢出低水平的HBV-DNA，可能由于HBV病毒的基因發(fā)生突變[2]，導致HBsAg抗原性改變，使血清HBsAg(+)不能檢出，這1例病人病情已經好轉，HBV-DNA轉陰。

3.6 9 8例第五組血清陽性率1.2%(1/98)乙肝病毒單項抗-HBc陽性者，這種情況表明血中可能與HB-cAb陽性多的情況下是免疫記憶所致，也有少部分是 HBV-DNA復制[3]。

3.7 第六組89例乙肝五項全陰的標本，有1例HBV-DNA陽性，肝細胞穿刺HBsAg(+)證實為慢乙肝可能與HBsAg表達低、含量少，不能檢出有關。

FQ-PCR檢測HBV-DNA含量具有簡便、快速、特異性強、準確定量的優(yōu)點。HBV-DNA含量能更清楚地反映乙肝患者傳染性強弱。乙肝五項的檢查影響因素較多，不能直接反映血清中的病毒含量，兩者互補，能為臨床診斷、治療方案的選擇及療效監(jiān)控提供更可靠的依據。

[1]郭 卉,董瑤佳,劉曉峰,等.乙肝血清學標志物與HBV-DNA含量關系的分析[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2010,28(4):417-418.

[2]孫華寶,曹 立,羅婭薇,等.乙型肝炎病毒基因變異及臨床相關性研究[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2009,27(2):153-154.

[3]徐光明,賀 欣,袁水斌,等.血清乙肝五項模式與HBV-DNA水平之間關系及其臨床應用[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2009,27(6):663-664.