鮑曼不動桿菌整合子與耐藥性的相關性研究

吳長生，伍嚴安，胡辛蘭，李 寧

(福建省立醫院檢驗科，福建福州 350001)

鮑曼不動桿菌是一種條件致病菌，對目前常用的多種抗菌藥物耐藥。整合子是一種與耐藥基因水平傳播有關的新的可移動基因元件，攜帶位點特異性重組系統組分，根據整合酶基因的DNA堿基序列的不同，整合子可以分為4類：I類、Ⅱ類、Ⅲ類和Ⅳ類整合子。I類、Ⅱ類和Ⅲ類整合子與細菌耐藥關系比較密切，又常被合稱為耐藥整合子(resistance integron，RI)。本研究通過簡并引物PCR法，調查福建省立醫院患者的標本中分離的鮑曼不動桿菌攜帶整合子的情況，并分析整合子與細菌耐藥性的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 93株鮑曼不動桿菌為2007年11月至2008年10月，從福建省立醫院臨床標本中分離，剔除耐藥表型完全一致的菌株。I類整合子陽性標準菌株V517由華南理工大學輕工與食品學院石磊教授惠贈，Ⅱ類整合子陽性對照株由福建CDC惠贈。

1.1.2 儀器 VITEK 2全自動細菌鑒定和藥敏分析儀 (法國bioMerieux公司)，BIOER Tc-25/H 基因擴增儀 (杭州博日科技有限公司)，FX-DY-252型水平電泳儀(上海復星高科技集團有限公司)，凝膠成像系統(UVItec limited)。

1.1.3 試劑 VITEK 2全自動細菌鑒定和藥敏分析儀所用試劑為法國bioMerieux公司產品。藥敏紙片和M-H(Mueller-Hinton)瓊脂為英國Oxoid公司產品。Chelexl00為BIO-RAD公司產品。Taq DNA聚合酶，dNTPs，Taq buffer(Mg2+Plus)，Hinf I 等均為TaKaRa公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細菌鑒定和藥敏試驗 采用VITEK 2全自動細菌鑒定和藥敏鑒定和藥敏分析儀，進行細菌鑒定和抗菌藥物敏感性測定。每批均以銅綠假單胞菌ATCC27853作為質控菌株進行質量控制，結果按美國臨床實驗室標準協會 (Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)標準進行判讀[1]。

1.2.2 細菌總DNA的提取 采用Chelex100法[2]，提取的細菌DNA，用紫外分光光度計測量260nm、280nm OD 值，OD260/OD280為 1.66～1.70。

1.2.3 整合子檢測及分類 參照文獻設計簡并引物[3]，由寶生物工程(大連)有限公司合成。上游引物為 hep35：5′-TGCGGGTYAARGATBTKGATTT-3′，下游引物為 hep36：5′-CARCACATGCGTRTARAT-3′，該引物可同時擴增整合子5’保守區的Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類整合酶基因，預計擴增片段為491bp。參考有關文獻[4-5]，采用25μl反應體系：上下游引物(l0μmol/L) 各 1.0μl，模板 1.0μl，dNTPs(200μmol/l)2.0μl，Taq buffer(Mg2+Plus)2.5μl，Taq DNA 聚合酶(5U/μl)0.125μl，超純水 17.375μl。參考有關文獻[5，6]和對循環條件的優化結果，確定以下PCR反應條件：94℃預變性 5min；94℃ 30s，52℃ 40s，72℃ 40s，循環35次；最后72℃延伸5min。簡并引物擴增的陽性產物用限制性內切酶Hinf I進行限制性片段長度多態性 (RFLP)分析， 酶切反應體系：PCR產 物8.0μl，10 × H Buffer 2.0μl，Hinf I(l0U/μl)1.0μl，超純水9.0μl。37℃水浴4h，酶切產物用含溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳分析 (電壓70V，時間30min)，對整合子進行分類，依據見表1[3]。

表1 整合子酶切分類依據

1.2.4 統計學分析 統計分析采用SPSS 13.0軟件，率的比較用卡方檢驗或Fisher確切概率法檢驗。

2 結果

2.1 整合子檢測及分類結果 在93株鮑曼不動桿菌中有22株檢出整合子，檢出率為23.6%，整合子檢測電泳圖見圖1。PCR-RFLP結果顯示均為Ⅰ類整合子，未檢出Ⅱ類和Ⅲ類整合子，整合子酶切分類電泳圖見圖2。

圖1 整合子檢測電泳圖

圖2 整合子擴增陽性產物酶切后電泳圖

2.2 I類整合子與鮑曼不動桿菌耐藥和多重耐藥的關系 對I類整合子陽性和I類整合子陰性的鮑曼不動桿菌的藥敏情況進行分析，結果顯示：哌拉西林、替卡西林/棒酸、頭孢他啶、頭孢吡肟、亞胺培南、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦、左旋氧氟沙星、慶大霉素、妥布霉素、復方新諾明共11種抗菌藥在整合子陽性組的耐藥率明顯高于整合子陰性組，具有統計學意義(P＜0.05)，詳見表2。

在I類整合子陽性的22株鮑曼不動桿菌中，多重耐藥菌有21株，占95.4%；而I類整合子陰性的71株鮑曼不動桿菌中，多重耐藥菌只占74.6%。對二組細菌的多重耐藥發生率進行比較，結果顯示：I類整合子陽性菌株的多重耐藥發生率比I類整合子陰性菌株高，兩者有顯著性差異(P＜0.05)，說明整合子與細菌多重耐藥的發生有關，見表3。

3 討論

表2 鮑曼不動桿菌I類整合子與耐藥表型的關系

表3 二組細菌的多重耐藥發生率的比較

鮑曼不動桿菌 (Acinetobacter baumanii，ABA)是引起醫院感染的常見條件致病菌，在臨床分離的非發酵菌中僅次于銅綠假單胞菌。ABA常可引起患有嚴重基礎性疾病和重癥監護室內使用呼吸機等侵入性裝置的患者的感染。

本研究中，ABA的耐藥現象十分普遍，多重耐藥菌株占細菌總數的77.4%，對青霉素類、頭孢菌素類、慶大霉素均具有很高的耐藥率(＞70%)，耐藥率較低的有頭孢哌酮/舒巴坦和阿米卡星，與國內相關報道相似[7，8]。

本研究應用的簡并引物PCR法，可同時擴增整合子5′保守區的I類、Ⅱ類和Ⅲ類整合酶基因，再通過PCR-RFLP分析確定整合子的類別，可節省實驗時間，降低成本，是一種對大量臨床菌株進行整合子篩選的理想方法。

本研究結果顯示，ABA中整合子的檢出率為23.6%，酶切結果顯示均為Ⅰ類整合子，明顯低于國內的相關報道[9]，而高于國外的相關報道[10]，推測主要是與標本的選擇和地域差異有關,本研究在收集標本時剔除了耐藥表型完全相同的菌株，避免了同一來源菌株的重復收集；國內的相關報道陽性率高達90%，可能與陽性菌株的暴發流行有關；而國外相關研究的標本來自于不同國家不同醫院。

細菌耐藥性通常由獲得耐藥基因引起，在抗菌藥物選擇性壓力下，耐藥基因的水平傳播是一個日益嚴重的問題，耐藥基因的水平傳播使耐藥菌株廣泛流行[11]。

整合子具有通過位點特異重組機制整合多個耐藥基因盒的能力，介導多藥耐藥的形成。本研究中，許多抗菌藥在I類整合子陽性組的耐藥率明顯高于陰性組，并且具有統計學意義；統計結果顯示，整合子與細菌多重耐藥的發生有關。

對整合子介導和傳播耐藥性的研究，有助于理解革蘭陰性菌耐藥性和多重耐藥性的分子基礎，為合理使用抗菌藥物和控制細菌耐藥性發展提供理論基礎。

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