鹿鞭線粒體DNA指紋鑒定﹡

劉 洋 張麗華 薄 艷

1.吉林省吉林市中心醫院藥學部，吉林吉林132002；2.北華大學藥學院，吉林吉林132013

中藥材的真偽優劣直接影響著中藥的質量和療效。許多研究建立了一系列有效評價藥材質量的方法，其鑒定標準也從最初僅有性狀，逐漸增加了顯微、理化、色譜、光譜等方法[1]。但是，對一部分藥材，例如鹿鞭，僅以上述方法難以達到鑒定目的。因此人們不斷研究更完善、更準確、更具科學性的方法來解決藥材鑒定問題。隨著分子生物學技術的飛速發展，特別是微量DNA提取技術和PCR技術的發展，從藥材中提取微量DNA進行分析，為用DNA分析技術鑒定藥材提供了可能。鹿鞭（Testis et penis cervi）乃名貴藥材，系鹿科動物梅花鹿（Cnippon temminck）、馬鹿（CelaphusL.）的雄性外生殖器。功效是補腎、壯陽、益精。常見偽品牛鞭，兩者性狀相似。市場上經常以牛鞭充當鹿鞭，較難區分。本實驗采用分子生物學方法，進行鹿鞭的DNA鑒定。

1 樣本

新鮮梅花鹿鞭1個，500 g。新鮮馬鹿鞭1個，1000 g。由長白山野生生物資源重點野外觀測實驗站提供。新鮮部分牛鞭1個，600 g，由吉林市牛馬行農貿大廳購買。

2 方法

2.1 新鮮品鹿鞭及牛鞭mtDNA的PCR鑒定

采用堿變性法提取并純化新鮮品和中藥材鹿鞭與牛鞭的mtDNA[2]。采用軟件Primer Premier5.0進行引物設計，Oligo 6.0進行驗證。由上海生工技術服務有限公司合成。上游引物 5’-CCCTCAGAATGATTGTCCTCA-3’，下游引物 5’-ATCCAACATCACAGCATGATG-3’。以提取的新鮮品鹿鞭及牛鞭mtDNA為模板，PCR擴增反應程序如下：94℃5 min，94℃30 sec，58℃ 30 sec，72℃ 30 sec，72℃ 10 min。新鮮品梅花鹿鞭、馬鹿鞭、牛鞭的擴增產物各取6 μL，加2μL 6×loading Buffer，點樣于2%瓊脂糖凝膠中，以1×TBE為緩沖液，DNA MarkerⅠ為DNA Mark，70 v電壓，進行電泳。30 min后，EB染色，凝膠成像分析系統觀察和分析結果。

2.2 序列分析

2%瓊脂糖凝膠電泳分離新鮮品鹿鞭的目的片段，片段回收，上海生工技術服務有限公司進行純化和測序。測序結果按照參考文獻進行比對[2]。

3 結果

3.1 新鮮品鹿鞭的PCR鑒定

以新鮮品梅花鹿鞭、馬鹿鞭及牛鞭線粒體DNA為模板，加入鹿鞭特異性引物后，梅花鹿鞭、馬鹿鞭可擴增出306bp大小的目的基因片段，牛鞭未能擴增出相應的基因片段。結果見圖1。

圖1 新鮮品鹿鞭的PCR鑒定結果圖

3.2 鹿鞭Cytb基因片段的序列分析

本研究中所測鹿鞭的線粒體Cytb序列與GenBank中梅花鹿鞭的序列同源性為99%，與牛鞭線粒體Cytb無同源性。

4 討論

鹿鞭為名貴中藥材，價格高，市場上屢見偽品，其鑒定研究主要集中在藥材的性狀鑒別和化學分析兩方面。本實驗采用堿變性改良法，可提取出1 5800 bp完整的鹿鞭mtDNA。同時，以提取的鹿鞭mtDNA 作模板，設計線粒體Cyt b基因特異引物可擴增306 bp片段，而以牛鞭為模板未擴增出相應的片段，測序結果顯示，Cyt b基因的306 bp片段序列與GenBank中梅花鹿及馬鹿鞭的序列同源性為99%。說明這對Cytb基因特異性引物可作為鹿鞭鑒定指標之一[3-7]。

從本研究結果來看，將分子遺傳學技術引入到組織、器官類的動物藥材的檢驗中是可行的，顯示用以上技術鑒定動物藥材的有效性和可靠性。

[1] 李璐瑒.直觀易行的傳統中藥鑒定方法[J].首都醫藥，2010，31（5）：87-89.

[2] 劉洋，楊明妍.梅花鹿鞭DNA指紋鑒定研究[J].時珍國醫國藥，2008，34（5）：790-793.

[3] 韓璐.內蒙古東周時期綿羊和山羊的線粒體DNA研究[D].吉林大學，2010：340-342.

[4] 宋紅梅，胡隱昌，王培欣，等.福壽螺線粒體DNA COⅠ基因序列測定及分類地位 [J].動物學雜志，2010，29（1）：63-66.

[5] 馮海永，韓建林.羊肉產品中若干動物源性成分的七重PCR檢測技術應用研究 [J].中國畜牧獸醫，2010，15（9）：29-31.

[6] 張學維，馬長華，白根本.塔里木馬鹿特異性PCR及PCR-RFLP鑒定[J]中華中醫藥雜志，2011，11（3）：44-45.

[7] 謝琦敏，方哲，葉忠偉.分子生物技術在現代中藥發展中的應用[J].北京中醫藥，2010，9（3）：124-126.