核酸檢測技術在無償獻血者血液篩查中的應用分析

馮秀梅 王 艷

吉林省吉林市紅十字中心血站，吉林吉林 132001

近年來，國內已有部分血站使用NAT篩查獻血者。根據我國現行的法定要求，采供血機構對獻血者病毒血清學檢測項目主要為HBsAg、抗-HCV、抗-HIV和抗-TP，ELISA方法檢測[1]的篩查模式已極大地降低了輸血傳播疾病的風險，但因輸血而患傳染病的情況仍然時有發生[2]，主要因為我國屬于肝炎的高發區，人群中HBsAg攜帶率為9.09%，HBV流行率＞60%[3]， 抗-HCV陽性率也達到了3.2%[4]，艾滋病也有快速發展的趨勢?，F有的血清學方法避免不了對病毒感染“窗口期”的漏檢，而近年來發展的高度敏感、特異的核酸擴增技術（NAT）可使HBV、 HCV和 HIV病毒的“窗口期”明顯縮短[5]，大大提高了輸血和血液制品的安全?，F將筆者所在血站2010年12月～2011年7月ELISA檢測陰性獻血者的標本進行NAT檢測的情況報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源

2010年12 月～2011年7月采集的無償獻血者全血標本中，經ELISA方法檢測陰性的標本共18 751份，其中男10 230人，女8 521人。采血后用3支5 mL EDTA抗凝真空試管（其中兩支帶分離膠，1管不帶分離膠），保存于2～8℃冰箱，24 h內分離血漿，1管不帶分離膠的用于免疫4項、ALT、血型等檢測，1管帶分離膠的用于NAT檢測，另外1管用于標本保存備用。

1.2 儀器

Roche Cobas S201全自動核酸提取、擴增檢測系統，Hamilton star全自動混樣儀，Cobas Ampilprep核酸提取儀，Cobas Taqmen Analyzer核酸擴增檢測儀，Fame24/20酶免分析儀，Freedom evo clinical全自動加樣儀，elecsys 2010電化學發光分析儀，KUBOTA 8420低速離心機，MPR-141OR冰箱。

1.3 試劑

ELISA 篩查試劑：HBsAg（上?？迫A、廈門新創），HCV（上海科華、廈門新創），HIV（珠海麗珠、北京萬泰）。NAT試劑：核酸定性篩查試劑盒（Cobas TaqScreen MPX test）。確證試劑：HIV、HCV、HBV（COBAS Ampliprep/ COBAS TaqMan），elecsys 2010電化學發光分析儀配套試劑。以上所使用的試劑均為國家生物檢定所批批檢定合格，且在有效期內使用。

1.4 方法

將用ELISA方法檢測陰性的標本，再用全自動加樣儀和全自動核酸提取、擴增系統進行混樣檢測，每一級混樣池包含6個獻血者標本，每個標本取167 mL血漿至一級混樣池，用全自動混樣議加樣，一級混樣池標本采用Cobas TaqScreen MPX test試劑，在全自動核酸提取儀中應用MGP磁珠分離技術原理提取核酸，核酸擴增檢測儀擴增檢測HBV、 HCV和 HIV靶序列，在Cobas S201系統服務器中自動判讀結果，每組檢測均設置質控對照（HBV/HCV/HIV-1-O/ HIV-1-M/ HIV-2），每個一級混樣池均含內對照，全自動核酸提取、擴增檢測系統檢出的陽性一級混樣池拆分為6個組，組成該一級混樣池的原始標本做單標本檢測，單標本檢測陽性判定為NAT陽性，單標本檢測陰性判定為NAT陰性。

1.5 確證實驗

將NAT檢測陽性的標本，再以另一種NAT試劑做單標本檢測，乙肝五項（HBsAg、抗 -HBs、、HBeAg、抗 -HBe、抗 -HBc）送至北華大學附屬醫院用電化學發光法檢測。

表1 NAT檢測陽性標本分項確證試驗

2 結果

2.1 NAT檢測情況

經ELISA法篩查陰性的標本18 751份進行NAT檢測，共篩查出陽性標本15份，陰性標本18 736份，陽性檢出率為0.08%（因羅氏血篩試劑是HIV、HCV和HBV 3項聯合檢測，尚不能區分具體項目）。

2.2 NAT檢測陽性標本分項確證情況

將Cobas S201系統檢出的15份陽性標本用另一種核酸檢測系統做確證試驗，進行分項鑒別，其中有4份未檢測到HBVDNA、HCV-RNA、HIV-RNA，11份標本檢測出HBV-DNA陽性，陽性檢出率為73.3%（11/15）。見表1。

3 討論

本研究結果顯示，18 751份陰性標本經Cobas S201系統檢測后有15份為陽性，陽性檢出率為0.08%。用確證檢測系統進一步檢測，結果陽性為11份，陰性4份。Cobas S201系統檢測的病毒類型主要是HBV、HCV及HIV-1-O、HIV-1-M、HIV-2型，確證核酸檢測系統檢出的病毒型主要是HBV、HCV和HIV-1-O型，根據2個系統各自的工作原理，4份標本確證核酸檢測系統未檢出，不排除屬于HIV-1-M、HIV-2型的可能[6]，又因筆者采用的是集中進行分項鑒別試驗的模式，實驗過程中標本保存須經過反復凍融或分裝，病毒RNA對溫度變化和環境中的RNA酶較敏感[7]相對比較容易降解，4份陰性標本不排除有這種可能性。對經分項鑒別試驗確認的11份HBV陽性標本的乙肝五項檢測，HBsAg雖陰性，但抗-HBe、HBeAg或抗-HBc陽性的標本共6份，其比率較高。據報道，我國普通人群和無償獻血人群的抗-HBe、HBeAg或抗-HBc的總體陽性概率為10%左右[8]，筆者統計的數據可認為是NAT陽性標本的病毒攜帶風險大于NAT陰性標本的原因。

Cobas S201系統為美國FDA批準應用于獻血者的血液篩查系統，采用磁珠捕獲的方法提取分離靶核酸片段，并以實時熒光PCR方法檢測血液標本的核酸濃度。本實驗NAT檢測采用混樣池檢測模式，將6份常規檢測陰性標本各取167 mL，混合至1個待測樣本管進行檢測，可以檢測出較微量的HBV DNA、HCV RNA及HIV RNA，靈敏度較高。在HBV、HCV和HIV的檢測中，HBV陽性檢出率遠遠大于HCV和HIV，乙型肝炎是經血傳播危害嚴重的病毒性傳染病，每年新發病例50萬[9]。目前在對乙肝病毒的篩查中，我國仍以HBsAg陽性與否作為篩查獻血者HBV感染的指標，HBV感染后最先存在血清中是HBV DNA，就算用靈敏度較高的ELISA試劑檢測抗原抗體也要經過50～80 d的“窗口期”[10]，因此ELISA方法對“窗口期”的漏檢不能消除。在發達國家，如美國經過10多年利用NAT檢測血液中的HIV和HCV，無償獻血者HCV RNA和HIV RNA陽性率下降至1/222 200和1/2 200 000[11]。自1993年起，歐美、日本以及我國香港等近20個國家和地區用NAT技術做獻血者血液篩查，研究表明，通過NAT檢測，可以將輸血傳播HBV、HCV和HIV的ELISA方法檢測 “窗口期”分別縮短25、59和11 d[12]。

從筆者所在血站的實驗數據分析可以看出，ELISA方法檢測陰性的標本，用NAT系統檢測后，仍有0.08%的陽性檢出率，其他城市如北京、深圳、青島、常州等血站的報道也闡明了NAT技術更為敏感的觀點，可以篩查出尚屬于“窗口期”的樣本，能夠大大提高輸血安全系數。

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