針藥并用對帕金森病模型小鼠紋狀體DA、NE和5-羥色胺影響

陸征宇,趙虹,陳潔,程波,宗蕾

?

針藥并用對帕金森病模型小鼠紋狀體DA、NE和5-羥色胺影響

陸征宇,趙虹,陳潔,程波,宗蕾

(上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院,上海 200437)

觀察平顫解郁方配合針刺治療對帕金森病模型小鼠紋狀體DA、NE和5-HT等神經遞質的影響。將成年C57/BL雄性小鼠28只隨機分為正常組、模型組、西藥組和針藥組4組,每組7只。采用高效液相色譜-電化學檢測法,測定各組小鼠紋狀體DA、NE和5-羥色胺(5-HT)的含量。模型組、西藥組和針藥組小鼠紋狀體DA、NE、5-HT含量均顯著低于正常組(＜0.01,＜0.05),西藥組和針藥組小鼠紋狀體DA、NE、5-HT含量顯著高于模型組(＜0.01,＜0.05)。平顫解郁方配合針刺治療可提高紋狀體下降的DA、NE、5-HT水平。

針刺;電針;帕金森病;大鼠;平顫解郁方;針藥并用

帕金森病(parkinson disease,PD)是一種中老年常見的神經變性疾病,選擇性神經遞質的降低可能是產生PD的危險因素之一。目前研究認為,黑質紋狀體系統以多巴胺為代表的單胺類神經遞質的減少是PD的一個重要病理生理特征。我們通過既往的臨床研究,發現平顫解郁方結合針灸治療具有較好的治療效果,能有效改善PD癥狀。本研究以C57/BL雄性小鼠為實驗動物,探討平顫解郁方配合針刺治療對PD小鼠紋狀體內多巴胺(dopamine,DA)、去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)、5-羥色胺(5-hydroxytryp- tamine,5-HT)等神經遞質水平的影響,從而為臨床研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

雄性8周齡C57/BL小鼠28只,體重20～25 g,購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司,隨機分為正常組、模型組、西藥組和針藥組4組,每組7只。

1.2 藥物制備

將熟地、生地、白芍、鉤藤、柴胡、制首烏、川芎等,根據文獻[1]方法制成2.0 g/mL水煎液,4℃保存備用。將左旋多巴/芐絲肼配制成相當于臨床等效劑量10倍的水溶液,得2.5 mg/mL溶液,隨配隨用。

1.3 主要試劑及儀器

1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)、多巴胺鹽酸鹽、去甲腎上腺素鹽酸鹽、5-羥色胺鹽酸鹽(美國Sigma公司)。LC210A型高效液相色譜儀(日本SHIMADZU)、Waters460電化學檢測器(美國Waters公司)、Hypersil ODS23柱(日本GL公司)、保護柱(DIKMA公司)、MicroMax RF高速離心機(國際儀器公司IEC)、LXJ2 ⅡB低速離心機(上海安亭科學儀器廠)。華佗牌無菌針灸針0.40 mm×25 mm毫針(蘇州醫療用品廠有限公司),G6805-2型電針儀(上海醫用電子儀器廠)。

1.4 動物模型制備

參照國內外較為公認的MPTP腹腔注射的方法[2]復制PD小鼠模型。隨機分組的小鼠適應環境10 d后開始給藥,其中模型組、西藥組、針藥組用生理鹽水溶解MPTP后,按30 mg/kg腹腔注射MPTP,每日1次,連續注射7 d,制備PD小鼠模型;正常組腹腔注射相應量生理鹽水,每日1次,連續注射7 d。

1.5 動物處理

模型復制后,各組動物分別給予相應的治療,每日1次,治療14 d。正常組給予生理鹽水灌胃(0.1 mL/ 10 g);模型組給予生理鹽水灌胃(0.1 mL/10 g);西藥組給予左旋多巴/芐絲肼灌胃(0.1 mL/10 g);針藥組給予針刺百會、風府、陽陵泉三穴,毫針針刺后接G6805-2型電針儀,連續波,頻率為2 Hz,電流強度1 mA,刺激15 min及平顫解郁方灌胃(0.1 mL/10 g)。小鼠在最后一次相應處理后,禁食、禁水,次日斷頭處死, 1 min內開顱取出全腦,在冰盤上解剖,準確分離取出紋狀體組織,立即轉入－70℃冰箱內保存待測。

1.6 指標檢測

采用高效液相色譜-電化學檢測法。取紋狀體組織勻漿,加正丁醇210 mL,混勻,于4℃下離心(10000 ×)15 min。取上清液,加0.11 mol/L HClO40.150 mL、正庚烷210 mL,旋渦振蕩3 min后低速離心(3000 ×)3 min。除去有機相,在下層的水相中加CHCl3210 mL,經旋渦振蕩3 min、低速離心3 min后,取上層水樣直接進樣,進樣量20.0mL。流動相為緩沖液(0.102 mol/L檸檬酸三鈉和0.105 mol/L磷酸氫二鈉):甲醇=90:10的溶液,經0.145mm濾膜過濾并超聲脫氣后使用,流速為110 mL/min。工作電極為玻璃碳電極,參比電極Ag/AgCl,電化學監測器設定電壓為＋650 mV。共測定3種單胺類神經遞質,其洗脫順序依次為NE、DA、5-HT。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 四組模型復制后行為

正常組小鼠在實驗過程中反應靈敏,攝食正常,無明顯異常表現。模型組、西藥組和針藥組小鼠在應用MPTP腹腔注射后都出現了不同程度動作減少、重復點頭、間歇性閉眼、向一側旋轉,噪聲或痛刺激后僅有睜眼凝視或驚恐反應、豎毛、頻繁竄蹦等急性海洛因樣反應,這些反應在第2次腹腔注射MPTP后2～5 min內產生,每次發作持續約5～30 min。注射MPTP第2天起小鼠逐漸出現暫時性(2～3 h)肢體行動遲緩、軀干震顫、動作減少、豎毛、尾巴過伸及爬桿試驗障礙,注射MPTP第6～7天上述表現最為顯著。模型組、西藥組和針藥組小鼠經治療行為逐漸恢復,但是部分西藥組小鼠在治療第13天起又出現運動障礙,表現為反復咀嚼、強制性啃咬。

2.2 四組紋狀體內DA、NE、5-HT含量變化

由表1可見,模型組、西藥組、針藥組DA含量均低于正常組(＜0.01,＜0.05),西藥組、針藥組DA含量高于模型組(＜0.01),西藥組與針藥組DA含量差異無統計學意義(＞0.05)。模型組、西藥組、針藥組NE含量均低于正常組(＜0.01),西藥組、針藥組NE含量高于模型組(＜0.01),西藥組與針藥組NE含量差異無統計學意義(＞0.05)。模型組、西藥組、針藥組5-HT含量均低于正常組(＜0.01,＜0.05),西藥組、針藥組5-HT含量高于模型組(＜0.05),西藥組與針藥組5-HT含量差異無統計學意義(＞0.05)。

表1 四組小鼠紋狀體DA、NE、5-HT含量水平(±s,ng/g)

注:與正常組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與模型組比較3)＜0.01,4)＜0.05

3 討論

帕金森病臨床主要表現為靜止性震顫、肌強直、動作遲緩和姿勢平衡障礙等癥狀。DA、NE和5-HT等神經遞質的異常在帕金森病的發病中起著一定的作用[3-7]。PD最顯著的生物化學特征是腦內DA含量減少。一般認為,當基底節中DA含量減少到70%以上時才出現臨床癥狀,運動遲緩和強直與黑質-紋狀體DA含量減少有直接關系[8]。NE、5-HT在紋狀體中的含量也相當高,在PD時,紋狀體區的NE含量輕度至中度降低,5-HT含量亦有所下降。

用MPTP所建立的PD小鼠模型是目前較為理想的PD模型[9]。MPTP本身并無毒性,其進入體內在膠質細胞單胺氧化酶B作用下轉變為甲基-苯基-雙氫吡啶,然后進一步轉化為甲基-苯基吡啶離子(MPP＋),MPP＋被DA轉運體主動攝取到DA神經元胞體內,再進入線粒體,抑制線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ的活性,使ATP合成減少,自由基生成增加,同時MPP＋還可以使細胞內乳酸堆積、Ca2＋平衡紊亂、一氧化氮合成增加、谷胱甘肽合成減少,這些因素均可加劇自由基的過度生成,降低細胞對自由基損傷的抵抗能力,最終導致DA能神經元變性、死亡[10,11]。另外,MPTP對NE能和5-HT能神經元也有一定的毒性作用,其機理尚不明確。

腹腔注射MPTP后小鼠產生急性海洛因樣反應可能是與MPTP對NE、5-HT的系統功能和阿片受體活性的影響有關。同時發現在連續給予左旋多巴治療一段時間后,小鼠會產生明顯的運動障礙。以往的研究認為這與長期應用多巴藥物后紋狀體D2受體過度激活有關。近期有研究認為這可能與紋狀體突觸后膜DA受體的波動性刺激有關,這種非生理性刺激破壞了基底節的功能網絡。由于紋狀體DA神經末梢受損,對紋狀體DA濃度的緩沖能力下降,短效左旋多巴血漿濃度的波動可能被直接傳輸到紋狀體,紋狀體DA受體受到紋狀體DA“脈沖”樣刺激,細胞內基因和蛋白表達失調、基底節輸出神經元放電模式改變,最終產生運動障礙。

帕金森病屬于中醫學“顫證”、“腦病”等范疇,根據PD的臨床表現,中醫學認為其基本病機是肝腎陰虛,患者常在肝腎不足的基礎上并發肝氣郁結,是病機的演變或夾雜;PD多為本虛標實之證,肝腎不足是為病之本,肝氣郁結乃為病之標,治療當標本同治,扶正與祛邪兼施,治療原則是補益肝腎,疏肝解郁。本實驗所用平顫解郁方系在長期臨床中反復調整篩選,該方熟地、生地補益肝腎為君藥,白芍、鉤藤柔肝熄風,柴胡疏肝解郁為臣藥,制首烏補益肝腎、川芎行氣解郁為佐藥,全方共奏補益肝腎、疏肝解郁之效。我們的臨床研究發現平顫解郁方對各期PD患者均有一定療效,能改善PD患者的運動癥狀和抑郁、便秘、乏力等非運動癥狀,可減少左旋多巴的用量,減少其副反應。本實驗中針刺選用百會、風府、陽陵泉組方。中醫學認為PD的病位在腦。《素問·骨空論》:“督脈者……上額交巔上……入絡腦”,“病變在腦,首取督脈”;百會為手足三陽經與督脈之會穴,位居于巔頂之上,開竅通絡止顫,又補下元虛損,健腦寧神,疏瀉肝風。風府穴為督脈經的腧穴,為治風之要穴。《行針指要賦》:“或針風,先向風府,百會中。”風府穴又為督脈經、陽維脈的交會穴,督脈走行到風府處,便入顱內,與腦府連系。《難經·二十八難》:“督脈者……上至風府,入屬于腦。”兩穴相配共奏通調腦絡,祛風止顫之功。現代研究認為,帕金森患者的全腦血流量都有下降,針刺可以增加腦血流量,從而改善腦部的血液循環,頭穴對腦血流的作用迅速而持久,這可否防止或延緩多巴胺能神經元變性,尚待進一步研究證實。陽陵泉是筋之會穴,為筋氣聚會之處。《難經·四十五難》:“筋會陽陵泉。”主治筋病,舒筋活絡,能解全身之顫動。而且研究發現[12],針刺曲池、陽陵泉兩穴位可使病人腦血管擴張,血流速度加快,明顯改善腦供血的情況,加速病灶側大腦組織細胞的恢復。本研究發現,經治療,針藥組和西藥組小鼠紋狀體DA、NE、5-HT含量顯著高于模型組。

綜上所述,平顫解郁方配合針刺治療能夠使PD小鼠紋狀體下降的DA、NE、5-HT水平升高,改善PD癥狀,且未見明顯不良反應,其詳細的機制有待進一步研究。

[1] 李儀奎.中藥藥理試驗方法學[M].上海:上海科學技術出版社, 1991:38.

[2] 陳生弟.帕金森病[M].北京:人民衛生出版社,2006:116-127.

[3] Slaughter JR, Slaughter KA. Prevalence clinical manifestations, etiol- ogy, and treatment of depression in Parkinson's disease[J]. J Neuropsychiatry Clin Neurosci, 2001,13(2):187-196.

[4] Philippe R, Miroslava D, Andrew L,. Depression in Parkinson's disease: loss of dopamine and noradrenaline innervation in the limbic system[J]. Brain, 2005,128(6):1314-1322.

[5] Schuurman AG, van den Akker M, Ensinck KTJL,. Increased risk of Parkinson's disease after depression: A retrospective cohort study[J]. Neurology, 2002,58(10):1501-1504.

[6] Cote L. Depression: impact and management by the patient and family[J]. Neurology, 1999,52(7 Suppl 3):S7-9.

[7] Mayberg HS, Starkstein SE, Sadzot B,. Selective hypometabo- lism in the inferior frontal lobe in depressed patients with Parkinson's disease[J]. Ann Neurol, 1990,28(1):57-64.

[8] Dunnett SB, Bjorklund A. Prospects for new restorative and neuropro- tective treatments in Parkinson's disease[J]. Nature, 1999,399(6738 Suppl):A32-39.

[9] Beal MF. Experimental models of Parkinson's disease[J]. Nat Rev Neurosci, 2001,2(5):325-334.

[10] Nicklas WJ, Vyas I, Heikkila RE. Inhibition of NADH-linked oxidation in brain mitochondria by 1-methyl-4-phenyl-pyridine, a metabolite of the neurotoxin, 1-methyl-4-phenyl-1,2,5,6-tetrahy- dropyridine[J]. Life Sci, 1985,36(26):2503-2508.

[11] Nicklas WJ, Youngster SK, Kindt MV,. MPTP, MPP＋ and mitochondrial function[J]. Life Sci, 1987,40(8):721-729.

[12] 劉靖,連平.針灸配合康復訓練治療中風偏癱60例臨床觀察[J].中華現代中醫學雜志,2006,2(7):634-636.

Effect of Combined Acupuncture and Medicine on Striatal DA, NE and 5-hydroxytryptamine in a Mouse Model of Parkinson Disease

-,,,,.

,2000437,

To investigate the effect of tremor and depression-relieving prescription plus acupuncture on striatal neurotransmitters DA, NE and 5-HT in a mouse model of Parkinson disease.Twenty-eight adult male C57/BL mice were randomly allocated to four groups: normal, model, Western drug and combined acupuncture and medicine, 7 mice each. Striatal DA, NE and 5-hydroxytryptamine (5-HT) contents were measured by high efficiency liquid chromatography-electrochemical determination in every group of mice.Striatal DA, NE and 5-hydroxytryptamine (5-HT) contents were significantly lower in the model, Western drug and combined acupuncture and medicine groups of mice than in the normal group (＜0.01,＜0.05) and significantly higher in the Western drug and combined acupuncture and medicine groups of mice than in the model group (＜0.01,＜0.05).Tremor and depression-relieving prescription combined with acupuncture can raise low striatal DA, NE and 5-HT levels.

Acupuncture; Electroacupuncture; Parkinson disease; Mouse; Tremor and depression-relieving prescription; Combined use of acupuncture and medicine

1005-0957(2011)01-0056-03

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2011.01.056

2010-10-28