供體年齡對德國肉用美利奴羊超數排卵及胚胎移植效果的影響

左北瑤 ，錢宏光 ，王子玉 ，汪立芹 ，郭志勤

（1.新疆巴州畜牧工作站，庫爾勒 841000；2.內蒙古自治區農牧業科學院；3.南京農業大學動物胚胎工程技術中心，江蘇 210095；4.新疆畜牧科學院農業部家畜繁育生物技術重點開放實驗室）

德國肉用美利奴羊（德美羊）是肉毛兼用品種，繁殖力高、被毛品質好，尤其是肉用性能突出，引入我國后在土種羊改良和細毛羊培育中起了巨大作用，如與中國美利奴羊（新疆型）雜交后，F1代在各階段平均體重比中國美利奴羊（新疆型）提高0.07～2.10 kg，體尺指標也有明顯改善［1］。為進一步提高德美羊的良種覆蓋率，亟需采用胚胎移植技術進行快速擴繁。但目前國內關于德美羊超數排卵、胚胎移植的研究較少。為充分利用不同年齡段的良種德國肉用美利奴羊，本試驗優化了超排方案，研究了供體年齡與超排和胚胎移植效果的關系，為進一步提高綿羊胚胎移植效率提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 供、受體 供體為純種德國肉用美利奴羊，按年齡分為青年（18月齡，配種未受胎）、老齡（60～72月齡，經產）以及幼齡母羊（7月齡，性成熟前）3組。受體為新疆地方品種巴音布魯克成年母羊。

1.2 超排及同期發情藥品 促卵泡素（FSH）：寧波三生藥業生產；促黃體素（LH）、孕馬血清促性腺激素（PMSG）、前列腺素（PG）、促黃體素：寧波生產；Y 形陰道栓（CIDR）、孕酮陰道海綿栓：澳大利亞生產。

1.3 供體的預處理

1.3.1 青年組及老齡組的預處理 間隔11 d 2次肌注PG（0.1 mg/只），挑選出發情時間在 36～48 h之間的母羊作為供體。供體母羊按方案設計分組，其中青年羊9只，老齡羊4只，置入CIDR，在放栓的第13天取出陰道栓，肌注PG 0.1 mg，試情，記錄發情日期。隨機挑選青年、老齡母羊各2只，在超排處理前情期的第2天分2次間隔12 h肌注FSH 20 u。

1.3.2 幼齡母羊的預處理 每只幼齡母羊肌注500 u的PMSG，挑選3 d內發情的2只作為供體，記錄發情日期。

1.4 供體的超排 本試驗主要是從漏配或配種未受胎的德美母羊群中選取供體，其繁殖性能參差不齊。為提高供體超排效果，采取了人工誘導發情與自然發情相結合的處理程序，即在誘導發情之后增加一個自然發情周期，在自然發情周期結束前超排。對已同期處理的供體，根據年齡和體重調整FSH劑量，總量為120～200 u，在情期的第13～15天連續3 d減量肌注FSH，并在第3天上午，注第5針FSH的同時注PG 0.1mg。第16天早上開始試情，對發情羊肌注促黃體素100 u，人工授精3～4次（每次間隔12 h）。

1.5 供體的采胚 在供體首次發情配種后第6.5天進行子宮角采胚［2］。在顯微鏡下判斷是否可用及胚胎發育階段，分為 16細胞（16C）、致密桑椹胚（compaction morula，CM）、囊胚（blastocyst，B）。

1.6 受體同期發情 在供體撤栓后的第4天將孕酮海綿栓置入同組受體陰道中，在放栓后的第10天肌注400u PMSG，第12天撤栓，肌注PG 0.1mg，翌日試情，標記發情羊。

1.7 胚胎移植 采用子宮角移植，選擇與供體發情同步（同天或早0.5 d以內）的作為同組供體胚胎的移植受體。以術后2情期未返情判定為妊娠。

1.8 統計分析 試驗數據采用SPSS 16.0軟件進行方差分析。

2 結果

2.1 供體年齡對德美羊超排效果的影響 由表1可見，15只供體共采集胚胎162枚，只均采胚數10.8枚，其中可用胚胎總數151枚，只均可用胚數為10.1枚，胚胎可用率93.2%。青年、老齡、幼齡母羊超排后只均可用胚數分別為10.9、10.3和6.0枚，青年、老齡組可用胚數顯著高于幼齡組（P＜0.05），可用胚率差異不顯著（P＞0.05）。單只最多采出可用胚16枚。

表1 供體年齡對德美羊超排效果的影響

2.2 供體年齡與德美羊胚胎發育速度的關系 供體首次發情配種后第6.5天時手術回收胚胎，顯微鏡下判斷各年齡組羊胚胎的發育階段，結果（表2）表明，回收的胚胎中囊胚所占比例幼齡組（24.9%）、青年組（23.5%）顯著高于老齡組（0）（P＜0.05），老齡組胚胎主要為致密桑葚胚（95.1%），說明幼齡、青年組供體的胚胎發育速度顯著快于老齡供體。

表2 供體年齡與德美羊胚胎發育速度的關系

2.3 供體超排前預注小劑量FSH對德美羊超排后卵巢黃體數量的影響 在超排處理前情期的第2天，預注小劑量FSH（20 u）的青年組和老齡組供體，其黃體數均顯著多于對照組（P＜0.05），老齡供體由10個提高到20個，青年組由12.3個提高到16.5個（表3），說明超排前預注小劑量FSH能顯著促進超排后卵泡成熟與排卵。

表3 供體超排前預注小劑量FSH對德美羊超排后卵巢黃體數量的影響

2.4 供體年齡對德美羊胚胎移植受胎率的影響 同期處理受體168只，其中162只受體發情，受體同期成功率96.4%，共移植受體122只，妊娠79只，妊娠率64.8%。青年組、老齡組、幼齡組的妊娠率分別為71.6%、58.3%和41.7%。青年組和老齡組供體母羊胚胎移植后的妊娠率顯著高于幼齡組（表4）。

表4 供體年齡對德美羊胚胎移植受胎率的影響

3 討論

3.1 供體年齡與德美羊超排效果及移植受胎率的關系 供體年齡對超排處理后德美羊回收胚胎數量和胚胎質量具有較大影響。青年、老齡組德美母羊超排后只均可用胚數分別為10.9枚和10.3枚，顯著高于幼齡母羊的6.0枚（P＜0.05），表明經產成年母羊和性成熟青年羊的超排效果比幼齡母羊好。這與趙曉娥［3］、張鎖林［4］等在波爾山羊、張果平［5］等在杜泊綿羊上的結果類似。青年、老齡組母羊的胚胎經移植后受胎率分別為71.6%、58.3%，顯著高于幼齡組的41.7%，說明經產成年母羊和性成熟青年羊所獲得胚胎質量相對較高，原因可能是性成熟前幼齡母羊卵巢機能及生殖內分泌系統的調控機能尚不完善，影響了卵母細胞的質量和胚胎發育過程。因卵母細胞的發育能力與供體日齡密切相關［6］，幼齡德美羊卵巢中卵母細胞經超排后雖能排卵和受精，但其中的部分卵母細胞可能胞質成熟不完全。因此選擇供體應以經產成年羊為首選，年齡不超過5歲，其次為青年羊；為提早利用優良種畜，縮短世代間隔，也可在7月齡以上的羔羊中初選發育快、體成熟早的個體，在超排程序上先注PMSG催情處理，然后以發情羊為供體超排。

3.2 供體年齡與德美羊胚胎發育速度的關系 6.5 d時回收的胚胎中囊胚所占比例幼齡組（24.9%）、青年組（23.5%）顯著高于老齡組（P＜0.05），說明老齡供體的胚胎發育速度相對較慢。為取得更高比例的適齡胚胎，回收胚胎時除要十分重視計算供體的發情配種時段與受體發情時段的準確匹配之外，對供體年齡因素亦不應忽略，如供體整體年齡偏老，采胚手術應適當后延，反之可適當提前；如供體年齡老幼混雜，幼齡羊采胚應在前，老齡羊應在后。

3.3 德美羊超排程序的優化 供體的超排效果取決于兩個方面：一是供體本身具備正常的繁殖機能，二是外源激素的剌激與內源的周期協同作用。根據這個原理利用PG處理挑選出繁殖機能正常的母羊，再利用孕酮海綿栓調節發情周期，然后在其自然情期用外源激素進行超排，能夠保證較好的超排效果。FSH在卵泡腔的形成過程中起重要作用，能剌激顆粒細胞的有絲分裂和卵泡液的形成，還可以通過增加LH感受器的數目而誘發顆粒細胞對LH的敏感性。母畜在排卵前的20～30 h出現第2次FSH高峰，其目的是啟動另一批卵泡形成卵泡腔，為下一個情期排卵做準備。排卵率高的羊此峰值明顯高于排卵率低的羊，而且分泌的FSH量與17 d后卵巢上有腔卵泡數量呈正比［7］。本試驗表明在超排處理前情期的第2天，用小劑量的FSH肌注做預處理，提高血清中FSH水平可顯著提高超排效果，使更多的卵母細胞成熟和排卵，與Armstrong在牛上的結果類似［8］。

4 結論

綜上所述，本試驗證明供體年齡顯著影響德美羊的超排效果及胚胎質量，以青壯年羊（2～5歲）的效果最好，但為了充分利用數量有限的良種個體，也可對老齡和性成熟前母羊進行超排。通過人工誘導發情與自然發情相結合的處理程序和低劑量FSH預處理改善了德美羊的超排效果，為今后進一步提高綿羊胚胎移植的效率提供了依據。

［1］劉武軍，楊菊清，喻世剛，等.德美與中美（新疆型）雜交后代體尺體重變化［J］.中國畜牧獸醫，2008，35（7）：131-134.

［2］郭志勤.家畜胚胎工程［M］.北京：中國科學技術出版社，1998.

［3］趙曉娥，武浩，權富生，等.波爾山羊胚胎移植試驗研究［J］.西北農業學報，2002，11（4）：92-94.

［4］張鎖林，王述宇.波爾山羊超數排卵方案的研究［J］.中國草食動物，2001，21（4）：10-14.

［5］張果平，王金文，王德芹，等.影響杜泊綿羊超數排卵效果的因素分析［J］.江蘇農業學報，2009，25（2）：324-328.

［6］Armstrong D T.Effects of maternal age on oocyte developmental competence［J］.Theriogenology，2001，55（6）：1303-1322.

［7］R Rajamahendran，R S Cansecoa，C J Denbowa，et al.Effect of low dose of FSH given at the beginning of the estrous cycle and subsequent superovulatory response in Holstein cows［J］.Theriogenology，1987，28（1）：59-65.

［8］Armstrong D T.Recent advances in superovulation in cattle［J］.Theriogenology，1993（39）：7-24.