中國美利奴羊CTNNB1基因SNP與羊毛直徑關聯分析

張艷花，王力儉，徐新明，瑪爾孜亞，于麗娟，拉扎提，阿扎提，周喜榮，田可川

（新疆維吾爾自治區畜牧科學院，烏魯木齊 830000）

近年來細毛羊育種者不斷探索通過分子育種手段尋找控制羊毛纖維直徑性狀的基因或標記來提高育種效率［1］。CTNNB（β-catenin）基因作為影響毛囊發育的 Wnt蛋白信號［2］通路中心環節［3-4］，對毛囊發育、毛囊生長起著重要作用［5］。研究發現WNT/β-catenin對毛囊再生時真皮乳頭的誘導特性的維持是必要的，毛囊形態發生過程和毛囊再生形態和信號的表達具有很大的相似性，β-catenin在表皮層化后未出現基板形態之前首次均一散在出現于臨近表皮的真皮間充質細胞。隨著表皮基板增厚，基板部位β-catenin信號的上調，散在表達的WNT/β-catenin 信號消失［7］。基板形成后，基板下部開始聚集的間充質細胞，間充質細胞聚集一定數量后也開始表達β-catenin。隨后毛囊開始下陷，形成毛芽。伴隨著毛囊下陷，β-catenin表達消失一段時間；毛囊成形后毛球部位出現毛囊圓錐時再次在圓錐部位出現。隨后毛母質、前皮質區、根鞘都出現WNT/β-catenin信號的表達上調。這種上調表達一直持續到毛囊成熟毛纖維形成毛干［4］。但CTNNB1基因作為影響羊毛直徑性狀的候選基因在國內尚未見有關研究報道。本研究擬通過以CTNNB1基因為候選基因，利用中國美利奴羊中發現的多態位點，運用最小二乘均值分析各多態位點與產毛性狀之間的關系，找到與產毛性狀相關聯的標記位點，以進一步提高細毛羊的生產性能，改善羊毛品質，為細毛羊經濟性狀的早期標記輔助選擇提供理論依據和技術貯備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源及采樣方法 實驗采集新疆鞏乃斯種羊場有系譜記錄的中國美利奴羊874只，實驗羊群體為周歲母羊。一次性針頭采集羊頸靜脈血液2mL，放入醫用肝素鈉抗凝試管，上下顛倒5次確?？鼓?，放入-20℃冰箱保存。同時采集每一只羊體側毛樣，用光學纖維直徑分析儀（OFDA100）測定分析該毛樣羊毛平均纖維直徑。

1.1.2 主要試劑 DP319血液基因組DNA提取系統、dNTPs、TaqDNA聚合酶、TaqDNA聚合酶反應緩沖液、DNA分子量標準（MarkerⅠ、MarkerⅣ）均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組提取 采用天根生化科技（北京）有限公司DP319血液基因組DNA提取系統，提取基因組DNA。應用紫外分光光度計和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度并估計含量，利用核酸蛋白定量儀測定其含量，稀釋到 100 ng/μL。

1.2.2 引物設計 根據Genbank公布的羊CTNNB1基因，得到mRNA部分序列（GQ372826.1），長度約為407bp，在NCBI及UCSC上查找比對，尋找與該基因同源性較高的物種的基因，通過比對發現綿羊CTNNB1基因mRNA序列與牛CTNNB1基因高度同源。以牛CTNNB1基因為參考序列，以羊的mRNA部分序列為模板，分3段設計引物。利用在線引物設計程序（http：//fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm）初步設計了32對引物，通過oligo6軟件檢測，選取合適引物6對，通過實驗篩選，最終確定了3對引物，如表1所示。

表1 CTNNB1基因測序引物序列

1.2.3 PCR過程 利用設計的3對引物進行擴增。預期的PCR產物長度為300 bp、1 200 bp、2 000 bp。反應體系：l0×Buffer擴增緩沖液2.0 μL，Mg2+（25 mM）1.2 μL，dNTP 混合物（2.5 mM）1.5 μL，10 pmol/μL 上下游引物各1.0 μL，TaqDNA 聚合酶（5u/μL）0.2μL，模板 DNA（100 ng/μL）1.0 μL，ddH2O 12.1μL。反應條件：①200～600 bp 片段，95 ℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環；②1 000～2 500 bp 片段，95 ℃ 8 min；95℃ 45 s，55 ℃45 s，72℃2.5 min，38個循環。根據擴增效果篩選3對引物用于后續實驗。

1.2.4 SNP位點篩選及分型檢測 隨機從13個不同公羊的女兒中，選取羊毛纖維直徑差異較大的40個個體的基因組，從每個DNA樣本中選取5 μL共200 μL的DNA混合構建成DNA池。選取擴增效果較好的3對引物進行擴增，將擴增產物分裝，各30 μL分別送至擎科生物公司及華大公司測序，分析測序峰圖查找SNP位點。根據檢測結果，使用美國西昆諾姆公司的Mass ARRAY對實驗群體進行SNP分型檢測，然后統計基因型。

1.3 數據分析 統計不同基因型的個體數量，計算基因頻率和基因型頻率，利用Popgene Version（3.2）軟件對SNP位點進行Hardy-Weinberg平衡檢驗。

采用SAS8.2中的MIXED過程對中國美利奴羊CTNNB1基因SNP位點多態性與羊毛纖維直徑、羊毛纖維直徑變異系數和羊毛產量性狀進行關聯分析，具體公式為：

其中，y為性狀表型觀察值；μ為性狀的群體均值；RAM為公羊家系；G為SNP效應；e為隨機殘差效應。

2 結果與分析

2.1 CTNNB1基因SNP位點多態性檢測 對混合池基因組DNA進行擴增，進行正反向測序。用Chromas軟件打開測序峰圖，用DNAMAN進行序列分析，發現了2個SNP突變位點，分別是819G＞A、974A＞G。

圖1 CTNNB1基因池的測序峰圖（圈圖處為突變位點，為反向測序結果）

2.2 CTNNB1基因SNP位點等位基因頻率和基因型頻率分析 CTNNB1基因的2個SNP多態位點中819G＞A突變位點處于Hardy-Weinberg平衡狀態，974A＞G位點處于極不平衡狀態，突變位點G等位基因頻率（0.30）明顯低于野生型A等位基因頻率（0.70）。

表2 SNPs等位基因頻率和基因型頻率及Hardy-Weinberg平衡檢驗

2.3 基因多態性羊毛直徑性狀的關聯分析 多重比較分析表明，CTNNB1基因974A＞G位點的AA基因型羊毛纖維直徑顯著低于GG及GA基因型、819G＞A位點的GA基因型羊毛纖維直徑顯著低于AA基因型。等位基因替代效應分析表明CTNNB1基因819G＞A位點對羊毛纖維直徑加性效應達到極顯著水平，顯性效應達到顯著水平，等位基因由A變為G時羊毛纖維直徑會降低。

表3 CTNNB1基因SNP位點對羊毛纖維直徑性狀的影響

表4 CTNNB1基因SNP位點在羊毛纖維直徑性狀上的加性效應和顯性效應

3 討論

1）CTNNB1基因作為影響羊毛直徑性狀的候選基因，在國內屬首次研究。本研究發現CTNNB1基因上與羊毛纖維直徑相關的2個SNP突變位點，表明CTNNB1基因與羊毛纖維直徑性狀有著較強的關聯。

2）本研究首次發現CTNNB1基因上819G＞A位點GA基因型羊毛纖維直徑顯著低于AA基因型，974A＞G位點的AA基因型羊毛纖維直徑顯著低于GG及GA基因型。因此CTNNB1基因作為新的影響羊毛纖維直徑的候選基因值得進一步探討，本研究為CTNNB1基因位點應用于羊毛纖維直徑標記輔助選擇提供了一定的參考。此外作為影響毛囊發育的Wnt蛋白信號通路中心環節基因CTNNB1，值得進一步采取定量分析研究其影響羊毛纖維直徑的機理。

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