環孢素A混合膠束的制備與理化性質考察

潘 昊 ，李 翔 ，張 婧 ，王東凱

(1.沈陽藥科大學藥學院，遼寧 沈陽 110016;2.江西中醫學院現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004)

環孢素A(cyclosporin A)是含11個氨基酸的環狀多肽類藥物，為目前臨床普遍應用的強效免疫抑制劑之一，臨床效果良好[1]。環孢素A親脂性強、生物利用度低，具有不可逆腎毒性[2]。膠束作為藥物載體具有提高藥物溶解度[3]和安全性、降低毒副作用、增強藥物療效等優點，是國內外新劑型研究的熱點之一。膽固醇硫酸酯鈉為膽固醇分子衍生后形成的具有親水性基團的兩性分子，具有無毒、無刺激性特點，結構上與膽鹽存在著一定的相似性，在水中可通過親脂性部分的疏水力或親水性部分的極性親和力與藥物分子作用形成膠束。與膽鹽磷脂混合膠束系統相比，膽固醇硫酸酯鈉/磷脂膠束制備工藝簡單、制劑成本低廉、穩定性更強，并且各成分均具有生物相容性。通過與磷脂的親水頭部和兩個疏水的尾部產生交連作用，可增加難溶性藥物的載藥量。因此，筆者以多肽藥物環孢素A為模型藥物、膽固醇硫酸酯鈉/磷脂為脂質材料，制備了環孢素A混合膠束并考察了其理化性質。現報道如下。

1 儀器與試藥

LC-10A型高效液相色譜儀(日本島津株式會社)，包括SPD-10A紫外檢測器、Anstar色譜工作站;LS 230型粒徑分析儀(美國Beckman公司);Delsa 440 SX型電位測定儀(美國Beckman公司);JM-1200 EX型透射電子顯微鏡(日本Jeol公司);8010型攪拌式超濾裝置(美國Millipore公司);RE-52AA型旋轉蒸發儀(上海青浦滬西儀器廠);85-2型恒溫磁力攪拌儀(上海司樂儀器廠);ZRD6-B型溶出儀(上海黃海藥檢儀器廠)。環孢素A(福建科瑞藥業有限公司，批號為050402);大豆磷脂(Lipoid公司，純度大于95%);膽固醇酰硫酸酯鈉(自制，純度大于90%);其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 制備

取處方量的膽固醇硫酸酯鈉、磷脂和環孢素A，用甲醇溶解，經旋轉蒸發除去有機溶劑，在圓底燒瓶底部形成透明薄膜，真空放置過夜后加水合介質，旋轉洗脫，靜置2.5 h，洗脫液用0.22 μm微孔濾膜除去不溶物，得環孢素A混合膠束。

表1 環孢素A混合膠束處方篩選的因素水平表

表2 環孢素A混合膠束處方篩選的正交試驗結果

經預試驗后，以包封率為評價指標，環孢素A與磷脂的質量比(因素A)、膽固醇硫酸酯鈉與磷脂的質量比(因素B)以及水合介質種類(因素C)為影響因素，采用L9(34)正交設計表篩選處方。正交設計的因素水平見表1，正交試驗結果見表2。由表2中極差值(Rj)可知，各因素對膠束包封率的影響程度大小依次為B＞A＞C，最優處方為A3B1C2，即環孢素A與磷脂的質量比為1∶7，膽固醇硫酸酯鈉與磷脂的質量比為1∶4，水合介質為雙蒸水。

2.2 含量與包封率測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱:DiamonsilTMC18柱(300 mm ×4.6 mm，10 μm);流動相:乙腈-甲醇-水(40∶35∶25);檢測波長:210 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:70 ℃;進樣量:20 μL。

2.2.2 方法學考察

稱取環孢素A對照品適量，定量轉移至容量瓶中，以甲醇定容，搖勻，作為標準貯備液。移取標準貯備液適量，用甲醇稀釋成1.0，5.0，10.0，25.0，50.0，100.0 μg/mL 的環孢素 A 溶液，進樣測定峰面積。以樣品色譜峰峰面積(A)對環孢素A質量濃度(C)進行線性回歸，得標準曲線方程 A=1.3×105C+1.0×105，r=0.999 7(n=6)。結果表明，環孢素A質量濃度在1.00～100.0 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。該法的專屬性、精密度及回收率均符合方法學要求。

2.2.3 樣品處理

取膠束溶液適量，用甲醇溶解，得透明澄清溶液，稀釋至適宜質量濃度后，用高效液相色譜法測定其環孢素A的質量濃度。

2.2.4 環孢素A含量與包封率測定

采用超濾法測定環孢素A混合膠束的包封率。取適量環孢素A混合膠束，置超濾器內，在磁力攪拌器上用超濾膜氮氣加壓超濾，收集續濾液。取續濾液適量，稀釋至適當質量濃度，測定藥物含量 Wfree。另取適量環孢素A混合膠束，按2.2.3項下方法處理，測定藥物含量 Wtotal。根據公式計算包封率(EE):EE=Wtotal-Wfree/Wtotal×100%。3批環孢素A混合膠束的環孢素A含量與包封率測定結果見表3。

表3 環孢素A混合膠束中環孢素A含量與包封率測定結果

2.3 理化性質考察

2.3.1 形態

采用負染色法處理樣品。在載有Formvar支持膜的銅網上滴環孢素A混合膠束，自然晾干后滴加0.3%磷鎢酸，用濾紙吸走多余液體，放置10 min，于透射電子顯微鏡下觀察膠束形態。結果見圖1。

圖1 透射電鏡圖(×30000)

2.3.2 粒徑

取3批環孢素A混合膠束，稀釋適當倍數后測定其粒徑及其粒度分布。3批樣品的粒徑均呈單峰分布，粒度范圍為85～205 nm，粒徑分布圖見圖2，粒徑測定結果見表4。

圖2 粒徑分布圖

表4 環孢素A混合膠束的粒徑和Zeta電位

2.3.3 Zeta電位

取3批環孢素A混合膠束，稀釋適當倍數后測定其Zeta電位。3批樣品的Zeta電位均為負(表4)。

2.4 體外釋放試驗

取環孢素A混合膠束適量，置處理過的透析袋中，兩端夾緊后固定于攪拌槳上，放入0.15%的膽固醇硫酸酯鈉磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)中，測定藥物累積釋放百分比。將攪拌轉速調為50 r/min，攪拌溫度為(37 ±0.5)℃，分別于 0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24 h 時取出透析介質1.0 mL，同時補入等溫空白釋放介質1.0 mL。樣品液用0.45 μm微孔濾膜過濾，按2.2.3項下方法處理樣品，記錄保留時間和峰面積，計算藥物的累積釋放百分比。由圖3可見，藥物釋放初期有突釋現象，此后環孢素A從混合膠束中釋放得比較緩慢，最初6 h釋放了藥量的(28.4±1.1)%，隨后藥物幾乎以恒定速率釋放，24 h內釋放藥物總量的(33.1±2.7)%。

圖3 累積釋放曲線

3 討論

環孢素A在水性介質中的溶解度極小，為滿足體外釋放所需的漏槽條件[4]，選擇5%葡萄糖注射液、0.1%膽固醇硫酸酯鈉磷酸鹽緩沖液、0.15%膽固醇硫酸酯鈉磷酸鹽緩沖液、0.3%膽固醇硫酸酯鈉磷酸鹽緩沖液以及0.3%吐溫-80溶液作為釋放介質，測定相應的藥物溶解度。結果表明，0.15%膽固醇硫酸酯鈉磷酸鹽緩沖液可滿足漏槽條件，因此被選為釋放介質。

環孢素A是一種難溶性的環狀多肽，膽固醇硫酸酯鈉膠團由于體積較小而對環孢素A的增溶能力有限。然而在膽固醇硫酸酯鈉/磷脂混合膠束中，磷脂的存在增大了膠束的體積以及膠束對藥物的親和力，從而大大提高了對難溶多肽藥物的增溶能力。體外釋放測定結果表明，一部分藥物分子可能分散在膠束的表面，因此在釋放初期產生藥物突釋現象;之后藥物需要通過內部的孔道擴散進入釋放介質，因此后期藥物幾乎以恒定速率釋放。

[1]黃玉鳳，王 慧，張國慶.環孢素在自身免疫性疾病中的臨床應用進展[J].藥學實踐雜志，2006，24(4):23-28.

[2]任吉忠，閔志廉，朱有華.環孢素軟膠囊在腎移植病人中的應用[J].中國新藥與臨床雜志，2000，19(5):398-400.

[3]Hammad MA，Müller BW.Solubility and stability of lorazepam in bile salt/soya phosphatidylcholine-mixed micelles[J].Drug Dev Ind Pharm，1999，25(4):409-417.

[4]Saarinen-Savolainen P，J?rvinen T，Taipale H，et al.Method for evaluating drug release from liposomes in sink conditions[J].Int J Pharm，1997，159(1):27-33.