高效液相色譜法測定荷膽膠囊中牛磺熊去氧膽酸含量

蘭 鴻，楊務彬，李元宏，陳鴻梅

(湖北醫藥學院附屬十堰市太和醫院，湖北 十堰 442000)

荷膽膠囊由熊膽粉[1]、干姜、薄荷油制成，具有解熱毒、去肝火、利膽定痛的功效，用于急性膽囊炎或慢性膽囊炎急性發作。熊膽粉為方中主藥，屬貴重藥材，具清熱、平肝、明目功效[2]，其含量高低直接影響到藥品的療效。筆者采用高效液相色譜法測定了荷膽膠囊中牛磺熊去氧膽酸的含量[3]，現報道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(美國Beckman公司)，包括125型溶劑輸送系統(雙泵)和166型檢測器;AE 240型雙量程電子分析天平;SB 2200型超聲波清洗器。牛磺熊去氧膽酸鈉對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110816-200507);樣品荷膽膠囊和缺熊膽粉的陰性樣品均由四川省新鹿藥業有限公司提供;甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱:Alltech Alltima C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:用磷酸調pH至4.4的甲醇-0.03 mol/L磷酸二氫鈉溶液(65∶35);檢測波長:210 nm;柱溫:室溫;流速:1 mL/min。在此條件下，牛磺熊去氧膽酸和樣品中其他組分的色譜峰可基線分離[4]，牛磺熊去氧膽酸峰與其相鄰峰的分離度大于1.5，以牛磺熊去氧膽酸峰計算的理論板數大于2 500，陰性對照品溶液在牛磺熊去氧膽酸色譜峰位置無相應峰出現(圖1)。

2.2 溶液制備

取經五氧化二磷減壓干燥至恒重的牛磺熊去氧膽酸鈉對照品10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含牛磺熊去氧膽酸鈉對照品0.1 mg(折合牛磺熊去氧膽酸為0.096 mg)的對照品溶液。取樣品內容物約0.2 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇超聲(功率250 W，頻率50 kHz)處理30 min，放冷后加甲醇至刻度，搖勻，濾過，棄去初濾液，取續濾液作為供試品溶液。取缺熊膽粉的陰性樣品內容物約0.2 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

線性關系考察:精密稱取在五氧化二磷容器中減壓干燥至恒重的牛磺熊去氧膽酸鈉對照品17.64 mg(折合牛磺熊去氧膽酸為16.93 mg)，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得每1 mL含牛磺熊去氧膽酸0.677 mg的對照品溶液。精密吸取上述對照品溶液 6，8，10，12，14，16，18 μL，注入高效液相色譜儀分析。以進樣量為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程 A=109 350.528 6 C+2 770.201 4，r=0.999 6(n=7)。結果表明，牛磺熊去氧膽酸進樣量在4.067 4～12.2 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗:精密吸取質量濃度為1.01 g/L的牛磺熊去氧膽酸對照品溶液10 μL，重復進樣5次，結果峰面積積分值的 RSD=1.29%(n=5)，表明儀器精密度良好。

穩定性試驗:取批號為070901的樣品，依法配制供試品溶液，室溫(20 ～25 ℃)下放置，分別在 0，1，2，4，8 h 時進樣，每次 10 μL，測定峰面積。結果的 RSD=1.75%(n=5)，表明供試品溶液在8 h內基本穩定。

重復性試驗:取荷膽膠囊(批號為070901)5份，按供試品溶液制備方法配制溶液，準確吸取10 μL，進樣，測定峰面積，計算牛磺熊去氧膽酸含量。結果平均含量為38.08 mg/g，RSD為1.03%(n=5)，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗:稱取已知含量的樣品(批號為070901，含牛磺熊去氧膽酸38.08 mg/g)約0.1 mg，共6份，精密稱定后置10 mL量瓶中，分別精密加入牛磺熊去氧膽酸鈉對照品溶液(每1 mL含牛磺熊去氧膽酸 0.677 mg)3.0，3.0，5.5，5.5，7.0，7.0 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液，準確吸取10 μL，進樣測定含量，計算回收率。結果見表1。

表1 牛磺熊去氧膽酸加樣回收試驗結果(n=6)

2.4 樣品含量測定

分別精密吸取牛磺熊去氧膽酸鈉對照品溶液(每1 mL含牛磺熊去氧膽酸0.677 mg)和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以外標法計算樣品中牛磺熊去氧膽酸含量，結果批號為070902，070903，070904，070905，071001，071002，071003，071101，071102，071103的10批荷膽膠囊中，牛磺熊去氧膽酸的含量分別為 31.11，41.32，41.74，42.31，38.89，36.99，35.27，39.72，35.56，36.36 mg/g，平均 37.93 mg/g(n=4)。

3 討論

本品內容物中熊膽粉為生品入藥，未經提取，故以甲醇作為提取溶劑。經試驗摸索，取樣品0.2 g，加甲醇10 mL，質量濃度與對照品溶液質量濃度匹配。制備供試品溶液時，比較了回流提取和超聲提取兩種方法，采用超聲提取測得的牛磺熊去氧膽酸含量高，且方法操作簡便。經考察，超聲提取30 min后，所測得的牛磺熊去氧膽酸含量無顯著性差異，故確定超聲提取時間為30 min。根據10批樣品的含量測定結果和《衛生部頒藥品標準新藥轉正標準(第十一冊)》熊膽粉項下牛磺熊去氧膽酸含量限度規定，暫定荷膽膠囊中牛磺熊去氧膽酸含量不得低于25 mg/g。

[1]WS3-09(B-09)-96(Z)，衛生部頒藥品標準新藥轉正標準(第十一冊)[S].

[2]徐愚聰，王 野.熊膽粉的研究進展[J].華西藥學雜志，2000，15(3):200-202.

[3]WS3-B-2641-97，衛生部頒藥品標準中藥成方制劑(第十三冊)[S].

[4]沈 俊，周 聃，張若丹，等.HPLC測定風熱清膠囊中的綠原酸和牛磺熊去氧膽酸[J].華西藥學雜志，2008，23(3):346-348.