高效液相色譜法測(cè)定江津梔子中梔子苷含量＊

黃群蓮，唐 燦，張彥燕，李云鵬，趙 劍

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川 瀘州 646000;2.瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 瀘州 646000)

梔子為茜草科植物梔子 Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實(shí)，主產(chǎn)于浙江、四川、江西、重慶、湖北等地，具有瀉火除煩、清熱、涼血解毒之功效，用于熱病心煩、黃疸尿赤、血淋澀痛、血熱吐衄、目赤腫痛、火毒瘡癰等證?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，梔子具有保肝、利膽、解熱、抗炎、抗病原微生物、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜等作用[1-8]。梔子的主要有效成分梔子苷、熊果酸和總有機(jī)酸具有良好的藥理作用及廣闊的應(yīng)用前景。梔子苷具有緩瀉、鎮(zhèn)痛、利膽、抗炎、治療軟組織損傷以及抑制胃液分泌和降低胰淀粉酶等作用，還可采用不同條件的發(fā)酵將其制成天然食用著色劑梔子藍(lán)和梔子紅，也是用于治療心腦血管、肝膽等疾病和糖尿病的原料藥物。為此，筆者采用高效液相色譜法測(cè)定江津梔子中梔子苷含量，旨在為建立江津梔子的質(zhì)量新標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 儀器與試藥

SSI高效液相色譜儀(美國科學(xué)系統(tǒng)公司);AS3120A Ultrasonic Cleaner;AP-01P真空泵;Haier BCD-176DA型電冰箱;SHH V21型長風(fēng)三用電熱恒溫水浴箱;ZK072型電熱真空干燥箱;RE-52B型旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器;AS 701KDT Ultrasonic Cleaner;UV-9200型紫外可見光分光光度計(jì);FA1104W型電子天平;Kodak Easy share Z7590型數(shù)位相機(jī)。甲醇(分析純);乙腈色譜純;多效蒸餾水(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科);梔子苷化學(xué)對(duì)照品(批號(hào)為110742-200516，供含量測(cè)定用，中國藥品生物制品檢定所);梔子產(chǎn)自重慶江津，經(jīng)課題組鑒定為茜草科植物梔子 Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:UltimateTMC18鍵合硅膠柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:乙腈 -水(10∶90);流速:1.0 mL/min，柱溫:25℃;波長:238 nm[9]。在此條件下，色譜圖見圖1。

2.2 溶液制備

將梔子于60℃減壓干燥1 h，粉碎過50目篩，取梔子粗粉，加5倍量甲醇，超聲提取60 min，提取3次，濾過，濾液揮至1 mL，轉(zhuǎn)入2 mL容量瓶中，定容，作供試品溶液。精密稱取梔子苷化學(xué)對(duì)照品3.2 mg(60℃減壓干燥24 h)，用無水甲醇定容于5 mL容量瓶中，即得質(zhì)量濃度為0.64 g/L的梔子苷對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:精密吸取對(duì)照品溶液 5.0，7.5，10.0，12.5，17.5 μL，置5 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，依法進(jìn)樣，記錄色譜圖。以峰面積(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y=-439 843.76+1 012 294.70X，r=0.999 2(n=5)。結(jié)果表明，梔子苷進(jìn)樣量在3.2～11.2 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn):精密吸取梔子苷對(duì)照品溶液(0.64 g/L)5 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定蜂面積。結(jié)果的 RSD=1.17%(n=5)，表明儀器精密度符合要求。

穩(wěn)定性試驗(yàn):精密吸取同一供試品溶液5 μL，于3.5 h內(nèi)每隔30 min測(cè)定1次。結(jié)果峰面積的 RSD=1.45%(n=8)，表明供試品溶液在3.5 h內(nèi)較穩(wěn)定，符合要求。

重現(xiàn)性試驗(yàn):取樣品適量，依法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果梔子苷含量的 RSD=1.789%(n=5)，表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗(yàn):分別取梔子苷化學(xué)對(duì)照品4.5，6.0，9.0 mg各2份，精密稱定，加入到已測(cè)定梔子苷含量的江津梔子粉末(50目粉末100mg，每1mg梔子苷含量為0.06463mg)中，每次加入2.5mL甲醇，超聲提取60 min，提取3次，合并濾液，精密吸取2.5 μL濾液進(jìn)樣，按擬訂的色譜條件測(cè)定。結(jié)果見表1。

表1 梔子苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4 樣品含量測(cè)定

取3份梔子樣品，依法制備供試品溶液，精密量取2.5 μL進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，以干燥品計(jì)算3份樣品中梔子苷含量。結(jié)果梔子干重為(4 370.31±0.228 1)mg，梔子苷含量為(264.743 0±2.527 3)mg，每1 mg藥材中梔子苷收率為(6.058±0.058)%。

3 討論

采用高效液相色譜法測(cè)定梔子中梔子苷含量，方法可靠，操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好。該法既可作為梔子含量測(cè)定的常規(guī)檢驗(yàn)方法，又可作為梔子制劑中梔子苷的含量測(cè)定方法。

有研究表明，梔子苷含量測(cè)定以超聲提取法較好，甲醇和80%的乙醇作為提取劑時(shí)效果最好[10]。高溫有助于梔子苷的溶出，但易導(dǎo)致有效成分被破壞。經(jīng)試驗(yàn)證明，提取溫度以70℃以下比較合適[11]。李志雄等[12]的研究表明，隨著溫度升高，梔子苷在藥材中的含量隨時(shí)間變化而呈下降趨勢(shì)，且溫度越高，下降幅度越大。常溫下梔子苷性質(zhì)穩(wěn)定，t0.9=2.83年。因此，在梔子苷的提取過程中，溫度不宜過高。提取溫度最好在60℃以下，供試品溶液可置0℃冰箱中貯存。與常規(guī)提取法相比，超聲提取技術(shù)能避免高溫、高壓對(duì)有效成分的破壞，但對(duì)容器的壁厚薄及放置位置要求較高，否則會(huì)影響藥材浸出效果;而且，目前超聲提取研究大多處于較小規(guī)模，若用于大規(guī)模生產(chǎn)，還有待于解決有關(guān)工程設(shè)備的放大問題。

關(guān)于流動(dòng)相的選擇，曾試用甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液(25 ∶5 ∶70)、甲醇 -水 -醋酸(80∶20 ∶0.1)、甲醇 -水(70∶30)等，結(jié)果以乙腈-水(10∶90)為流動(dòng)相時(shí)，梔子苷具有良好的線性關(guān)系和分離度，表明在此條件下，性質(zhì)和結(jié)構(gòu)相近的多種梔子環(huán)烯醚萜苷能有效分離，測(cè)定簡(jiǎn)便快捷。2005年版《中國藥典(一部)》即采用該流動(dòng)相。

在進(jìn)行精密度試驗(yàn)時(shí)，室外溫度高達(dá)35℃，室內(nèi)溫度高達(dá)28℃。因?qū)φ掌啡芤菏怯杉状寂渲贫?，在如此高溫下，甲醇具有很?qiáng)的揮發(fā)性，故穩(wěn)定性和精密度試驗(yàn)的 RSD相對(duì)較大，但仍在正常范圍內(nèi)。因此，在測(cè)定時(shí)最好控制室溫在20～25℃。

影響梔子苷含量的因素主要有采收時(shí)間和炮制水平。通過試驗(yàn)表明，梔子幼果的梔子苷含量比成熟果實(shí)的含量要高。其主要原因可能是成熟果實(shí)中梔子苷轉(zhuǎn)變?yōu)闂d子酸或其他物質(zhì)，梔子苷的含量降低，但仍有待于進(jìn)一步研究。不同的炮制方法、溫度和時(shí)間對(duì)梔子苷的含量也有影響。梔子直接干燥后，梔子苷含量降低，而經(jīng)籠蒸或水燙后再干燥的含量變化不大，表明梔子經(jīng)籠蒸或水燙，基本起到了殺酶保苷的作用。對(duì)于各梔子炮制品，隨著炮制的程度(炒黃、炒焦、炒碳)越深，其梔子苷量越低[13]。

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