高效液相色譜法測定銀翹解毒顆粒中綠原酸含量

馮 兵，錢 妍

(1.重慶市急救醫療中心藥劑科，重慶 400014;2.重慶醫科大學第二附屬醫院藥劑科，重慶 400010)

銀翹解毒顆粒由金銀花、連翹、牛蒡子等9味中藥組方，具有疏風解表、清熱解毒的功效，用于治療風熱感冒、發熱頭痛、咳嗽、口干、咽喉疼痛，臨床療效良好[1]。其質量標準中有荊芥、連翹、牛蒡子的薄層色譜鑒別項，但沒有含量測定的要求。筆者建立了測定金銀花活性成分綠原酸含量的高效液相色譜法，結果滿意，可為進一步提高銀翹解毒顆粒的質量標準提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀;BP 211D型電子天平(德國Sartorius);SB 2200型超聲波發生器(必能信超聲有限公司)。綠原酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號為110753-200413);銀翹解毒顆粒(太極集團重慶桐君閣藥業有限公司，批號為10010001，10030002，10040005);乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil KR100-5C 柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈-0.4%磷酸溶液(11∶89);柱溫:25℃;檢測波長:327 nm;進樣量:10 μL。理論板數按綠原酸峰計算應不低于5 000。

2.2 溶液制備

取綠原酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加80%甲醇溶液制成每1 mL含26 μg的溶液，作為對照品溶液。取本品0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理(功率250 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用80%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。取銀翹解毒顆粒處方中除金銀花外的其余藥材，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性考察:取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液，依法進樣測定。結果陰性對照品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上基本無干擾，色譜圖見圖1。

線性關系考察:精密吸取綠原酸對照品溶液(0.025 8 g/L)2.5，5.0，10.0，15.0，20.0 μL，注入液相色譜儀，依法測定，以對照品進樣量(μg)為橫坐標、峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程 Y=2977.5 X-0.896 6，r=1.0000(n=5)。結果表明，綠原酸進樣量在 0.064 5～0.516 0 μg范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

重復性試驗:取同一批樣品(批號為10040005)6份，依法制備供試品溶液并測定含量。結果綠原酸的平均含量為1.26%，RSD=1.2%(n=6)，表明方法重復性良好。

精密度試驗:精密量取同一質量濃度的對照品溶液10 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，連續進樣測定。結果的 RSD=1.1%(n=5)，表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗:取同一批已知含量的樣品(批號為10040005，含量3.21 mg/g)，每份約0.20 g，共7份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入已稀釋的綠原酸對照品溶液(12.644 μg/mL)50 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液，依法測定含量，計算回收率。結果見表1。

表1 綠原酸加樣回收試驗結果(n=7)

穩定性試驗:取同一份供試品溶液，分別在 0，2，4，8，12，24 h時依法進樣測定。結果的 RSD為0.32%(n=6)，表明供試品溶液自制備后24 h內測定基本穩定。

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，平行測定3次，取平均值。結果批號為10010001，10030002，10040005的樣品中綠原酸含量分別為 3.21，3.24，3.22 mg/g(n=3)。

3 討論

根據處方，每1 g銀翹解毒顆粒含金銀花0.536 g。按2005年版《中國藥典(一部)》金銀花含量測定項下規定，綠原酸的含量限度為不得少于1.5%，推算成品中綠原酸的理論含量應不低于8.04 mg/g。根據3批樣品的含量測定結果，綠原酸含量的平均值為3.22 mg/g，成品轉移率為40%。考慮綠原酸對光和熱不穩定、提取不完全以及保存期等影響因素，成品轉移率基本合理。

取對照品溶液，在200～400 nm波長處進行紫外掃描，結果溶液在327 nm波長處有最大吸收，其他成分在該波長處無吸收干擾，故選擇測定波長為327 nm。在選擇綠原酸提取條件時，曾對同一批樣品的提取溶液和提取時間進行了考察。結果用50%甲醇與80%甲醇提取效果相當，但采用50%甲醇時供試品溶液過濾困難，故選擇80%甲醇為提取溶劑;超聲處理30 min比10 min和20 min提取完全，效果更好。曾參考文獻[2-3]，分別選用甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(15∶85∶1∶0.3)、甲醇-水-磷酸(28∶72∶0.1)、乙腈-0.4%磷酸溶液(8∶92)、乙腈-0.2%磷酸溶液(12∶88)為流動相進行試驗，根據分離情況，最后選擇乙腈-0.4%磷酸溶液(11∶89)為流動相，可使綠原酸與其他成分很好地分離，且陰性對照無干擾。

試驗過程中發現，綠原酸遇光、熱有分解現象，應采用棕色瓶貯存并及時測定配置好溶液的含量，剩余溶液應置40℃冰箱保存備用。

使用本法測定綠原酸含量，樣品預處理簡單，有效成分分離較好，保留時間適宜，操作方法簡單快捷，結果準確可靠。因此，本法可作為銀翹解毒顆粒的質量控制方法。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學工業出版社，2005:602-603.

[2]張 丹，李章萬.HPLC測定金銀花、茵陳及其10種中成藥中綠原酸的含量[J].藥物分析雜志，1996，16(2):83.

[3]馬 柯.高效液相色譜法測定清咽顆粒中綠原酸的含量[J].中南藥學，2006，4(6):451-453.