因寧片對甲亢大鼠肝細胞凋亡調節蛋白Caspase-3和Bcl-2表達的影響

周 靜，王成蹊，潘弟儀，周 濤，侯連兵

(南方醫科大學南方醫院藥學部，廣東 廣州 510515)

甲狀腺功能亢進癥(hyperthyroidism)簡稱甲亢，可影響全身多系統、多器官功能，近年來甲亢合并肝臟損害在臨床上多有報道。目前關于甲亢合并肝損害的發病機制尚不清楚，研究發現細胞基因異常調控及凋亡機制參與了其病理損傷過程，故推測細胞凋亡是造成肝損害的重要因素[1]。因寧片是南方醫院治療甲亢的醫院制劑，能有效控制甲亢的癥狀和體征[2]，并對肝臟有保護作用。本研究旨在觀察因寧片對甲亢大鼠肝細胞凋亡相關蛋白半胱天冬酶-3(Caspase-3)和B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)的影響，探討其藥理作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

SD大鼠，SPF級，體重180～220 g，雌雄各半，購自南方醫科大學動物實驗中心，動物許可證號為SCXK粵2006-0015。甲狀腺片(40 mg/片，上海實業聯合集團長城藥業有限公司，批號為20090501);因寧片(由黃芪、當歸、生地、鱉甲、麥冬等9味藥材組方，廣州南方醫院院內制劑，批號為20051230);甲亢靈片(湖南飛鴿藥業有限公司，批號為0901052)。SDS電泳系統(北京君意東方電泳設備有限公司);半干轉膜儀(美國Bio-rad公司);Kodak Image Station 2000MM成像系統(美國 Kodak公司);磁力攪拌器(PH baiskT/C);多標記微孔檢測儀(VICTOR3)。

1.2 方法

1.2.1 分組與試驗方法

取60只SD大鼠，按體重、性別相近原則隨機分為6組，每組10只，即空白對照組(A組)，模型組(B組)，因寧片低劑量組(C1組)、中劑量組(C2組)、高劑量組(C3組)，甲亢靈陽性對照藥組(D組)。喂養適應1周后，除A組以等量生理鹽水灌胃外，其余5組灌胃給予甲狀腺片1.2 g/(kg·d)。造模30 d后，除A組繼續給予等量生理鹽水灌胃、B組繼續灌胃甲狀腺片外，其余4組在給予甲狀腺片的同時分別灌胃給予因寧片0.6，1.2，2.4 g/(kg·d)和陽性藥甲亢靈1.2 g/(kg·d)，各組均再連續給藥30 d。末次給藥后24 h，以10%水合氯醛350 mg/kg麻醉，腹腔靜脈采血，4 000 r/min離心10 min，取血清，用放射免疫法測血清三碘甲狀腺原氨酸(T3)、甲狀腺素(T4)、促甲狀腺激素(TSH)，用全自動生化儀檢測血清天門冬酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)，按試劑盒說明書操作。取肝臟，液氮速凍后，放置-80℃冰箱待測。

1.2.2 Western-Blot法檢測Caspase-3和Bcl-2蛋白水平

組織蛋白樣品提取:稱取大鼠的肝臟組織100 mg，剪碎，每50 mg組織加入300 μL Western和IP細胞裂解液(之前加入蛋白酶抑制劑和苯甲基磺酰氟)，于冰上靜置60 min，低溫高速離心2次(每次以12 000 r/min離心10 min)，取上清液，即為提取的肝臟組織總蛋白。

蛋白質定量(BCA蛋白定量法):以Solutian A加Solutian B(50∶1)配制BCA工作液，充分混勻。以1∶30稀釋蛋白樣品，按說明書加標準品及樣品至96孔板中，每孔稀釋至20 μL，加入200 μL BCA工作液，混勻，37℃放置30 min。測定562 nm波長處的吸收度，根據標準曲線計算出蛋白濃度。

十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)與Western印跡:1)樣品處理。吸取150 μg肝臟組織總蛋白，加入5倍體積電泳上樣緩沖液(Tris-Cl 250 mmol/L，pH=6.8，10%十二烷基磺酸鈉，500 mmol/L二硫蘇糖醇，50%甘油，0.5%溴酚藍)，98℃加熱 5 min，變性。2)跑膠。灌制12%SDS-PAGE分離膠，5%SDSPAGE積層膠，上樣150 μg肝臟組織總蛋白(體積大約25 μL)。3)電泳。恒壓80 V、維持40 min，當溴酚藍前沿進入分離膠時，將電壓提高到120 V、維持90 min直到溴酚藍到達分離膠底部，根據Mark條帶的相對分子質量切下目的蛋白和內參。4)半干轉膜。恒流120 mA，維持70 min，將蛋白從SDS-PAGE凝膠轉至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5%的脫脂奶粉封閉1.5 h，TBS-T洗脫液洗脫，每次5 min，洗3次。5)加一抗:兔多克隆抗體Caspase-3以1∶300稀釋，兔多克隆抗體Bcl-2以1∶500稀釋，兔多克隆抗體βactin以1∶1 000稀釋，4℃孵育過夜。TBS-T洗脫液洗脫，每次5 min，洗3次。6)加二抗:鼠抗、兔二抗以1∶2 000稀釋，室溫孵育2 h，用 BeyoECl Plus發光液顯影。7)分析:以 Kodak Image Station 2000 MM成像系統采集圖像，將獲得圖像用Image Tool 3.0圖像處理軟件分析，用Caspase-3/β-actin代表Caspase-3的相對表達量，以Bcl-2/β-actin代表Bcl-2的相對表達量。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠血清甲狀腺功能與肝功能變化

結果見表1。與A組比較，B組血清T3和T4水平升高，而TSH反饋性降低，肝功能出現明顯異常;治療后，C1，C2，C3組和D組T3和T4水平均降低，TSH水平升高，肝功能明顯改善，與B組比較有顯著性差異(P＜0.05)，且因寧片各組呈現劑量依賴性，高劑量組作用最明顯。

表1 各組血清甲狀腺功能和肝功能指標比較(n=10，±s)

表1 各組血清甲狀腺功能和肝功能指標比較(n=10，±s)

注:與 B 組比較，△P ＜0.05，▲P ＜0.01(下表同)。

組別 甲狀腺功能 肝功能A組B組C1組C2組C3組D組T3(nmol/L)2.15±0.82▲6.74±1.73 5.82±1.66△4.61±0.83△4.27±0.62△4.87±1.05△T4(nmol/L)35.21±9.91▲183.61±22.79 125.36±15.87△98.61±10.05△85.32±17.25△106.59±19.29△TSH(mU/L)3.47±0.13▲1.76±0.07 2.63±0.50△2.78±0.74△2.89±0.81△2.82±0.63△ALT(U/L)49.27±8.63▲108.25±21.31 86.44±10.72△75.22±12.87△69.39±10.15△88.13±11.08△AST(U/L)134.94±18.55▲289.36±36.73 217.33±24.19△191.83±15.94△182.45±16.80△205.09±19.92△

2.2 對甲亢大鼠肝組織Caspase－3和Bcl－2蛋白表達的影響

結果見表2、圖1和圖2。可見，對Caspase-3和 Bcl-2蛋白表達的影響大小排序為C3組、D組、C2組。

表2 各組大鼠肝組織Caspase-3和Bcl-2蛋白表達水平比較(±s)

表2 各組大鼠肝組織Caspase-3和Bcl-2蛋白表達水平比較(±s)

組別A組(n=10)B組(n=10)C1組(n=10)C2組(n=10)C3組(n=10)D組(n=10)Caspase-3蛋白0.952 2±0.022 8▲1.270 7±0.022 7 1.220 8±0.022 4 1.138 3±0.026 3△0.920 6±0.016 0▲0.962 7±0.032 1▲Bcl-2蛋白1.020 6±0.014 2▲0.576 7±0.034 4 0.697 7±0.448 4 0.885 7±0.012 2△0.936 2±0.008 3▲0.884 2±0.011 1△

圖1 Western Blot測定各組Caspase-3和Bcl-2蛋白表達情況

圖2 各組Caspase-3和Bcl-2蛋白表達水平比較注:與 B組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01。

3 討論

甲狀腺激素可影響機體所有組織器官的代謝過程。從1874年Habershon[3]首次描述甲亢患者合并肝損害后，相關的病例在臨床上被廣泛報道，但有關動物實驗研究不多，鮮有中藥復方治療甲亢合并肝損害的實驗報道。甲狀腺和肝臟的相互作用包括甲亢全身作用繼發的肝損害和甲狀腺激素對肝臟的直接作用。多數情況下，肝臟損害表現為非特異性脂肪變，包括脂肪浸潤、胞質空泡化、核不規則、線粒體數量減少、嵴消失等改變。越來越多的證據表明，細胞凋亡在非酒精性脂肪變(包括肝缺血-再灌注損傷、肝炎、肝腫瘤等)中起重要作用[4]。國外也有報道，甲亢鼠肝臟存在細胞凋亡過程異常亢進[5]。

天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)在細胞凋亡的過程中起關鍵作用，細胞凋亡各個階段都可以檢測到不同程度的Caspase增高。Caspase在組織中含量的改變決定了細胞凋亡的進展方向[6]。凋亡是蛋白酶級聯切割的過程，其中Caspase-3處于核心位置，不同的蛋白酶切割Caspase-3酶原，活化的Caspase-3又進一步切割不同的底物，導致蛋白酶切割級聯放大，從而激活核酸酶破壞細胞結構，DNA裂解使染色質濃縮、細胞皺縮，形成凋亡小體，最終使細胞走向死亡[6]。Caspase-3是執行性Caspase，因此被稱為死亡蛋白酶。本研究顯示，甲亢模型組Caspase-3蛋白表達明顯增加，表明肝細胞凋亡亢進;各治療組Caspase-3蛋白表達與模型組比較明顯下降，以因寧片高劑量組最明顯，表明因寧片能抑制肝細胞凋亡的核心因子Caspase-3的表達，這可能是因寧片抑制細胞凋亡、保護肝組織的重要作用機制之一。

B細胞淋巴瘤/白血病-2家族位于線粒體外膜上，包括抗凋亡蛋白(Bcl-2，Bcl-XL等)和促凋亡蛋白(Bax，Bad 等)。其中Bcl-2是一種重要的凋亡抑制蛋白，具有保護細胞的功能，Bcl-2的過度表達可引起細胞核谷胱甘肽的積聚，導致核內氧化還原平衡的改變，從而降低了Caspase的活性，阻止凋亡誘導因子和細胞色素C從線粒體的釋放，抑制凋亡[7]。本研究結果顯示，甲亢鼠Bcl-2蛋白表達下降，說明甲亢時抗凋亡蛋白表達抑制;經藥物治療后，各組Bcl-2蛋白表達明顯上調，肝細胞凋亡減少，說明因寧片對肝細胞凋亡及凋亡相關蛋白的表達有一定的作用。

本研究中觀察到，在給大劑量甲狀腺激素造成轉氨酶(AST和ALT)升高的同時，肝組織Caspase-3蛋白表達明顯上調、Bcl-2蛋白表達明顯下降，說明凋亡是Caspase依賴性的，過多的甲狀腺激素使大鼠肝組織細胞凋亡平衡被打破，凋亡通路中的執行蛋白酶被激活，抗凋亡蛋白表達受抑制，細胞凋亡亢進，從而造成肝細胞損害。高、中、低劑量的因寧片和陽性藥甲亢靈能降低血中甲狀腺激素T3及T4水平，降低轉氨酶含量，逆轉凋亡異常亢進。高、中劑量的因寧片明顯降低Caspase-3蛋白的表達，提高凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達。可見，因寧片的作用呈現出良好的劑量依賴性量效關系。

因寧片以消癭軟堅、解毒散結原理組方，治療甲亢的臨床效果顯著，能降低血中甲狀腺激素的水平，改善甲亢癥狀和體征。本研究證明，因寧片能顯著抑制甲亢時肝細胞凋亡，從而減輕肝損傷、保護肝臟。為明確因寧片的藥理作用機制，對肝細胞凋亡的其他信號轉導的作用尚有待進一步研究。

[1]Kumarl A，Sinha1 RA，Tiwari1 M，et al.Hyperthyroidism induces apoptosis in rat liver through activation of death receptor-mediated pathways[J].Journal of Hepatology，2007，46(5):888-898.

[2]張 薇，侯連兵，李 平，等.因寧片對實驗性陰虛大鼠的藥效學研究[J].中藥材，2007，30(3):326-328.

[3]Habershon SO.Exophthalmic goiter，heartdisease;jaundice:death[J].Lancet，1874，1:510-512.

[4]Panasiuk A，Dzieciol J，Panasiuk B，et al.Expression of p53，Bax and Bcl-2 proteins in hepatocytes in non-alcoholic fatty liver disease[J].World J Gastroenterol，2006，12:6 198-6 202.

[5]Upadhyay G，Singh R，Kumar A，et al.Severe hyperthyroidism induces mitochondria-mediated apoptosis in rat liver[J].Hepatology，2004，39(4):1 120-1 130.

[6]Contreras JL，Vilatoba M，Eckstein C，et al.Caspase-8 and Caspase-3 small interfering RNA decreases ischemia/reperfusion injury to the liver in mice[J].Surgery，2004，136(2):390-400.

[7]Girisx M，Sc M，Erbil Y，et al.Heme Oxygenase-1 Prevents Hyperthyroidism Induced Hepatic Damage via an Antioxidant and Antiapoptotic Pathway[J].Journal of Surgical Research，2009，4(13):1-10.