以殼聚糖為主要成分的新型標本保存液防霉實驗研究

徐琦煜 劉佳明 周鐵麗 楊新東 羅新華

(1.溫州醫學院附屬第一醫院,浙江 溫州 325000;2.溫州醫學院,浙江 溫州 325035)

標本發霉一直是醫學教學、臨床病理檢驗和法醫等工作中遇到的棘手問題,目前所用的尸體標本通常經防腐固定處理后,浸泡于5%福爾馬林(主要成分為甲醛)溶液中進行濕保存,防腐效果雖好,但對人體黏膜的刺激大,直接損害醫學教學者和臨床工作者及醫學生的身體健康,并污染周圍環境,而且在使用過程中,會出現標本外露部分霉變的情況,液面也會出現一層薄而透明的霉膜。尸體標本一旦霉變,再用甲醛殺菌,尤其是霉菌,效果不佳。霉變的標本給教學、臨床和科研帶來了諸多影響,使其失去使用價值,而且霉斑還影響外觀,長時間、大量接觸霉菌也會危害身體健康。本課題組研制了一種以天然抗菌劑殼聚糖及其衍生物[1-2]為主要成分的新型尸體標本保存液代替甲醛保存標本。為了了解新型保存液的保存效果,作者對霉變尸體標本中的霉菌進行分離鑒定,了解尸體標本霉變的優勢霉菌,并對傳統甲醛保存液與新型標本保存液的防霉效果進行比較。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)新型標本保存液的主要成分:殼聚糖,雙乙酸鹽,Na2EDTA,氯化鈉,甘油;(2)標本來源:溫州醫學院解剖學實驗室的尸體標本,高溫30℃、濕度90%條件下存放一段時間,定期觀察,當標本出現霉變時,取樣進行霉菌的分離鑒定;(3)霉菌分離培養基:PDA培養基、查氏培養基均參照文獻[3]配制;(4)主要試劑:真菌總DNA提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司,Taq酶和dNTP購至天根生化科技(北京)有限公司,引物ITS1和ITS2由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成,其它試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 尸體標本霉菌的分離、純化 無菌拭子采集霉變樣本接種于霉菌培養基中,置30℃孵箱中培養,第2天起觀察菌落生長情況,挑取可疑菌落,涂片染色進行初步鑒定,并用選擇性培養基再次進行純化培養,并將純化的菌株轉入PDA斜面培養基培養,充分產孢后冷藏備用。

1.2.2 尸體標本中霉菌的鑒定 分離、純化的霉菌采取形態學方法,結合系統發育學進行鑒定[3-4]。(1)菌落形態特征觀察和培養特征:直接挑取霉菌的菌絲體及孢子制片鏡檢,或用玻片培養法連續鏡檢,描述霉菌的培養性狀、菌落特征、孢子形態、產孢結構等;(2)ITS rDNA鑒定:將篩選菌株的孢子接入PDB液體培養基中,28℃搖床培養24小時,過濾獲得菌絲,提取真菌基因組總DNA,用引物為ITS1和ITS2擴增18S rDNA和5.8S rDNA之間的序列,PCR擴增產物送英濰捷基(上海)貿易有限公司測序后,將獲得的DNA序列輸入GenBank,用Blast程序與數據庫中的所有序列進行比較分析,確定霉菌種類。

1.2.3 微生物致霉(腐)性測定 把分離到的主要

致霉菌分別接種到新鮮的尸體標本上,然后分別放入帶有 30mL無菌水的滅菌三角瓶中密封,置于28℃下培養,以接種無菌培養基為對照,觀察微生物對尸體標本有無致霉(腐)性。

1.3 評價指標

1.3.1 保存液殺菌性能評價 采用紙片抑菌法比較自制尸體保存液和傳統保存液的殺菌性能,每個濃度保存液對每種菌各測10次,計算抑菌環直徑的平均值和標準差;瓊脂稀釋法檢測新型保存液對三種主要致霉菌的最低抑菌濃度。

1.3.2 保存液防霉性能穩定性評價 采用紙片抑菌法檢測使用中的保存液的抑菌效果,并觀察保存液的性狀。

1.3.3 新型保存液安全性能評價 通過小鼠灌胃和兔子皮膚、耳朵、眼結膜接觸試驗評價新型保存液的安全性能。

2 結 果

2.1 霉菌的分離、純化和鑒定結果 60多份尸體標本霉變樣本進行分離、純化,共得到209株菌,保存在PDA斜面上,出現頻率較高的三株霉菌菌株,編號分別為WZ-01、WZ-02和WZ-03。根據形態特征、序列同源性以及系統發育樹分析結果,參考《中國真菌志》(第5卷)、《真菌鑒定手冊》等,初步鑒定WZ-01為木霉菌屬(Trichoderma sp)、WZ-02為曲霉屬(Aspergillus sp)、WZ-03為鐮孢菌屬(Fusarium sp)。

2.2 微生物致霉(腐)性 三株霉菌均具有對新鮮尸體標本的致霉(腐)性,致霉速度較快、程度較重。

2.3 新型標本保存液抑菌效果評價

2.3.1 新型標本保存液與傳統標本保存液的抑菌效果比較,見表1。新型標本保存液與福爾馬林保存液比較,無顯著性差異(P＞0.05)。

表1 兩種防霉劑抑菌環直徑比較(,單位:mm,n=10)

表1 兩種防霉劑抑菌環直徑比較(,單位:mm,n=10)

新型保存液濃度(%)福爾馬林保存液濃度(%)菌 種0.05 0.1 0.20.05 0.1 0.2 WZ-0135±1.240±1.345±1.0 40±1.643±1.348±1.8 WZ-0234±1.238±1.539±1.6 32±1.137±1.638±1.8 WZ-0322±0.822±1.124±0.9 25±1.226±1.126±0.9

2.3.2 新型保存液對三種主要致霉菌的最低抑菌濃度(MIC)分別為:WZ-01:＜0.0125μ g/mL,WZ-02:＜0.0125μ g/mL,WZ-03:0.025μ g/mL。

圖1a-1c 已使用半年的新型保存液的抑菌效果圖

2.4 新型保存液防霉性能穩定性檢測結果 使用半年的保存液仍具有明顯的防霉效果,具有抑制或殺死三種主要致霉菌作用(見圖1a～1c),其抑菌環直徑與新配保存液基本相同,并且保存液一直清澈透明,在保存缸和箱內的液面和內壁均未發現霉點。

2.5 新型保存液的安全性 新型保存液對小鼠的最小致死量為(LD50)＞3600mg/kg,根據化學品急性毒性分級標準,新型保存液為低毒類且具有很好的使用安全性。小鼠急性毒性試驗結果顯示小鼠灌胃給藥后,無叫聲異常、震顫、驚厥、運動失調、流涎、流淚、流鼻涕、呼吸困難、腹瀉等現象發生。兔子皮膚、耳朵、眼結膜接觸試驗結果均未發現兔子皮膚、耳朵有異常表現,用新型保存液滴眼后1小時,眼結膜輕度充血,滴眼后6小時充血消失,眼結膜恢復正常。說明新型保存液對眼的刺激性很小,可認為對動物眼基本無刺激性。

3 討 論

福爾馬林用于尸體防腐是國際上通用的手段,其他防腐劑雖有零星報道,但都沒有達到福爾馬林的效果。文獻顯示,對尸體標本保存材料的探索,主要是解剖工作者在研究[5-6]。本課題組綜合多專業的知識,開發出以金屬絡合劑、蛋白交聯劑、滲透調節劑和食品級防霉防腐劑和水為組份的組合物,其主要成分殼聚糖、Na2EDTA、雙乙酸鹽、氯化鈉、甘油等通過抑菌/殺菌、抗氧化、調節滲透壓、保濕等聯合作用起到防腐防霉效果。

尸體標本發生霉變主要是因為尸體標本本身就是霉菌生長的良好基質,當尸體標本含水率高于13%,或尸體標本相對濕度超過70%時,如尸體標本中有霉變微生物存在,在一定溫度條件下,尸體標本就有可能發生霉變。本試驗從大量霉變標本中分離出209株霉菌,確定了三種優勢的致霉菌,并對其致霉效果進行了驗證。

本研究組對新型標本保存液的防霉效果、穩定性、安全性等進行評估,結果表明:新型標本保存液與傳統保存液福爾馬林相比,對不同致霉菌的抑菌作用有一定的差異,但總體上均有很好的抑菌效果,新型保存液從保存效果和物理性狀等方面均有很好的穩定性且具有較理想的生物安全性。

綜上所述,作者研制出的尸體保存液具有安全無毒、保存效果穩定等優點,從根本上解決了甲醛對人體的危害及對環境污染等問題,也能夠滿足教學和科研的需要。

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