白首烏C-21甾體苷體外抑制大鼠膠質瘤細胞生長的作用

王一奇，楊 波，張如松，魏爾清

(1.浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053;2.浙江大學醫學院藥理學系，浙江 杭州 310058)

白首烏系蘿藦科鵝絨藤屬植物耳葉牛皮消(Cynanchum auriculatum Royle ex Wight)的干燥塊根，是傳統的補益中藥。現代研究表明，C-21甾體苷是白首烏的主要活性成分，它可以有效清除羥自由基和氧自由基，調節免疫，保護肝臟和神經細胞［1-2］。研究表明，C-21甾體總苷(CG)有確切的體內外抗腫瘤作用［3-4］。按CG極性大小做進一步分離，得到A、B、C三個部分，即CGA、CGB、CGC。其中CGB具有顯著的抗腫瘤活性，且毒性較小，目前已經從中分離鑒定了四個C-21甾體苷類化合物，其化學結構如圖1所示［5-6］。研究表明，CGB及其所包含的化合物對人乳腺癌(MCF-7)、人肝癌(BEL-7402)等體外培養的細胞株，以及小鼠移植性腫瘤 H22、S180的生長都有確切的抑制作用［7-9］，但是對神經腫瘤的抑制作用至今尚無報道。神經膠質瘤是顱內常見的惡性腫瘤，而且多數為高度惡性的星形細胞瘤，治療十分困難。本實驗在前期研究的基礎上，首次評價了CGB對體外培養的神經膠質瘤細胞生長的抑制作用，并且初步評價了其誘導細胞凋亡與阻滯細胞周期的作用。

圖1 CGB中四個C-21甾體苷類化合物的結構圖Fig.1 Chemical structure of four C-21 Steroidal Glycosides in CGB

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 大鼠膠質瘤細胞(C6)由浙江大學醫學院藥理學系魏爾清教授提供。

1.1.2 藥物及試劑 白首烏苷B部分(CGB)由本實驗室從白首烏藥材(經浙江中醫藥大學張如松教授鑒定為耳葉牛皮消Cynanchum auriculatum Royle ex wight的干燥塊根)中提取分離純化(提取分離工藝見方法1.2.1)。100目和200～300目硅膠購自青島海洋化工廠;硅膠柱色譜用甲醇、氯仿為分析純;DMEM培養基、胰蛋白酶購自Gibco公司;胎牛血清購自杭州四季青生物材料公司;MTT購自生工生物工程(上海)有限公司;Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒、PI細胞周期檢測試劑盒購自聯科生物技術有限公司。

1.1.3 儀器 Thermo Forma細胞培養箱(生命科學國際有限公司);CKX41倒置顯微鏡、BX51熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司);680型全自動酶標儀(美國BIO-RAD公司);FACSCalibur型流式細胞儀(美國 Becton Dickson公司);AB104-N型電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)。

1.2 方法

1.2.1 藥物提取、分離 白首烏藥材80 kg粉碎后，以甲醇提取，再經氯仿提取，氯仿可溶部分投入正己烷，得正己烷不溶部分，干燥，得到白首烏總苷(CG)約2.4 kg(3%)。CG先后用100～200目和200～300目硅膠經柱層析分離純化，用氯仿-甲醇體系梯度洗脫，借助薄層層析分析，取薄層板上的中部斑點對應的流分，減壓回收，所得的白首烏苷B部分(CGB)約65 g(0.08%)。CGB經K-K反應及L-B反應檢識為C-21甾體類化合物。體外試驗時CGB以二甲亞砜(DMSO)配制成12 g/L的貯存液，試驗前用培養基稀釋至相應濃度。

1.2.2 細胞培養及細胞活性檢測 用DMEM培養基(含10%胎牛血清)培養細胞，每3 d更換新鮮培養液。待細胞鋪滿培養瓶底部時，用0.25%胰酶消化，收集細胞，以1×107/L的密度接種單細胞懸液于96孔培養板，每孔100 μl。設只加培養液、不加細胞和藥物的空白調零孔和不加藥、加細胞、溶劑及培養液的對照孔，均設四個復孔，預培養1 d后加入CGB，使藥物終濃度為 30、60、120 mg·L－1，繼續培養24 h、48 h或72 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μl，孵育 4 h，吸凈孔內液體，每孔加入 DMSO 150 μl，震蕩 10 min，使結晶物充分溶解，用酶標儀于490 nm處測各孔吸光度A值。給藥72 h后，在加入MTT前，于光學倒置顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。

1.2.3 細胞凋亡及細胞周期檢測 細胞以每瓶1×106個接種于50 ml培養瓶，預培養1 d后加入 CGB，使藥物終濃度為 30、60、120 mg·L－1，繼續培養24 h，收集細胞，按照試劑盒說明用Annexin V/PI染色后，流式細胞儀測細胞凋亡率;或收集細胞，用70% 冰乙醇－20℃固定24 h后，按照試劑盒說明用PI染色，流式細胞儀測細胞周期。

2 結果

2.1 CGB對C6細胞活性的影響 CGB 30、60、120 mg/L給藥72 h后，細胞數量明顯減少，部分細胞皺縮變圓(圖2A);CGB 30、60、120 mg/L給藥24、48、72 h后，C6細胞活性明顯降低(P＜0.001)，且給藥濃度越大、給藥時間越長，下降幅度越大(圖2B)。

2.2 CGB誘導C6細胞凋亡的作用 CGB 30 mg/L給藥24 h后，細胞未發生明顯凋亡和壞死;CGB 60、120 mg/L給藥24 h后，細胞凋亡率和壞死率均明顯升高(圖3)。

2.3 CGB對C6細胞周期的影響 CGB 30、60、120 mg/L作用24 h后，G0/G1期細胞比例增加(P＜0.05)，S期細胞比例明顯減少(P＜0.01，圖4)。

3 討論

圖2 CGB對C6細胞活性和形態的影響Fig.2 Effects ofCGB on cellviability and morphology in C6 cells

本實驗結果表明，CGB 30、60、120 mg/L 對體外培養的大鼠膠質瘤細胞C6細胞的生長有顯著的抑制作用;CGB 60、120 mg/L能誘導細胞凋亡，阻滯細胞周期，使G0/G1期細胞比例明顯增加，S期細胞比例明顯降低。雖然有關白首烏C-21甾體苷類成分對體外培養的腫瘤細胞的細胞毒作用已有多篇文獻報道，但是對神經腫瘤的作用，本研究屬首次報道。

圖3 CGB誘導C6細胞凋亡的作用Fig.3 Inducing effect of CGB on apoptosis of C6 cells

圖4 CGB對C6細胞周期的影響Fig.4 Effect of CGB on cell cycle in C6 cells

本研究發現的CGB作用特點與文獻報道一致。彭蘊茹、王冬艷等人曾在肝癌細胞中證實，白首烏C-21甾體苷類成分有誘導腫瘤細胞周期G0/G1期阻滯的作用、并誘導細胞凋亡，其誘導凋亡的劑量也與本實驗結果基本一致［3-4］。但是，也有文獻報道，CGB中所包含的兩個C-21甾體苷類化合物誘導人乳腺癌細胞MCF-7凋亡的劑量較高，在80 mg/L作用72 h時才出現明顯的凋亡率升高和典型的細胞核形態變化［8-9］。而本實驗結果表明，CGB 60 mg/L作用24 h時細胞凋亡率就顯著升高。分析原因有三方面:一是腫瘤細胞類型不一樣，導致藥物效應不一致;二是藥物不完全一樣;三是檢測凋亡的方法不一樣。文獻中檢測凋亡采用PI單一染料標記DNA，本實驗采用Annexin V-PI雙標記。前者檢測凋亡的原理是凋亡細胞核內DNA會形成凋亡小體溢出，導致核內DNA含量減少。通過計數核內DNA減少的細胞數量就可以計算凋亡率。這種檢測可能會導致一部分凋亡早期的細胞被遺漏。因為細胞核內DNA片斷化往往出現在凋亡晚期。在凋亡早期時，細胞核內DNA斷裂尚未發生，但細胞膜的改變已非常明顯，即原先存在于細胞膜內表面的磷脂酰絲胺酸(PS)暴露于膜外表面。Annexin V在鈣離子存在的環境中，可以迅速結合膜外表面的PS，靈敏地檢測出早期凋亡細胞，因此，本實驗采用的Annexin V-PI雙標記檢測凋亡更靈敏、準確［10-11］。

綜上所述，本實驗首次證明白首烏C-21甾體苷類成分對體外培養的神經膠質瘤細胞生長具有顯著抑制作用，該作用與誘導細胞凋亡和阻滯細胞周期有關。這將為今后該類藥物的開發提供線索和依據。目前對細胞凋亡的通路及細胞周期阻滯的分子機制已經比較明確，如Cyclin D、CDK4、CDK6對 G0/G1期起調控作用，Cyclin E、CDK2對G1晚期細胞進入S期起調控作用［12］。今后還需要深入研究白首烏C-21甾體苷類化合物對這些分子的作用機制。

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