骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞-海藻酸鈉凝膠治療脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究

史晨悅，阮玲琴，馮依慧，方嘉霖，宋晨驕，袁張根，丁悅敏，2

(1.浙江大學(xué)城市學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310015;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理系，浙江 杭州 310058)

近年來(lái)隨著我國(guó)高空作業(yè)事故、交通事故及地質(zhì)災(zāi)害的頻繁發(fā)生，脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)患者逐年增多。SCI最終?？蓪?dǎo)致受損脊髓節(jié)段以下肢體運(yùn)動(dòng)和感覺(jué)能力的喪失，即發(fā)生癱瘓，給家庭和社會(huì)帶來(lái)極大的負(fù)擔(dān)。而長(zhǎng)期以來(lái)SCI的治療一直是個(gè)難題，近年來(lái)干細(xì)胞移植治療給脊髓損傷后的功能修復(fù)帶來(lái)了新希望，是最近SCI修復(fù)研究的熱點(diǎn)之一［1］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一種多功能干細(xì)胞，具有多潛能性，MSCs移植治療研究已經(jīng)涉及脊髓損傷、多發(fā)性硬化、帕金森病和阿爾茨海默病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病［2］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究均表明，MSCs移植治療SCI后，MSCs可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞或分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)損傷脊髓修復(fù)和神經(jīng)功能恢復(fù)［3］?？梢?jiàn)MSCs移植是SCI修復(fù)治療中的一種有效手段。但需要指出的是，在干細(xì)胞治療的移植載體選擇和植入方式等方面尚存在許多問(wèn)題。

海藻酸鈉(sodium alginate，SA)是褐藻中普遍存在的酸性多糖，在二價(jià)陽(yáng)離子存在條件下可交聯(lián)形成網(wǎng)狀水凝膠。該凝膠具有很好的親水性，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)易于滲透擴(kuò)散，且其酶解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用，故在組織工程研究中日益受到重視［4］。近來(lái)已經(jīng)有研究者研究了海藻酸鈉對(duì)MSCs的生物學(xué)效應(yīng)［5-6］，將海藻酸鈉作為細(xì)胞移植的載體用于脊髓損傷的治療，并觀察到運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)［7］。但生物材料在使用前都需要進(jìn)行滅菌處理，由于海藻酸鈉受熱不穩(wěn)定［8］，經(jīng)過(guò)滅菌后其理化性質(zhì)可能會(huì)發(fā)生改變，這種改變也可能會(huì)影響細(xì)胞的活性。海藻酸鈉作為細(xì)胞移植載體，其制備方法的不同，對(duì)MSCs的生物學(xué)特性帶來(lái)的影響及其在SCI治療中的效果尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 海藻酸鈉(SA)和四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)sigma公司。胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。神經(jīng)絲NF-200抗體，F(xiàn)ITC抗兔熒光二抗購(gòu)自博士德生物工程公司。

1.2 海藻酸鈉凝膠制備 分別以生理鹽水和去離子水作為海藻酸鈉的溶劑，比較海藻酸鈉凝膠的溶解性。具體方法為:先稱取海藻酸鈉粉末，將粉末緩緩加入裝有少量溶劑的離心管中，同時(shí)邊加粉末邊加剩余溶劑，最后用旋渦混合器震蕩5 min后55℃水浴加熱過(guò)夜。為比較不同滅菌方法對(duì)海藻酸鈉凝膠理化性質(zhì)的影響，分別以液態(tài)形式(已配制成凝膠)和固態(tài)形式(粉末)對(duì)海藻酸鈉進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，固態(tài)滅菌的粉末進(jìn)一步在無(wú)菌條件下配成凝膠，用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3 小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mMSCs)的分離、培養(yǎng)和純化 取出生7 d的ICR雄性小鼠兩側(cè)股骨，剔除肌肉等其他組織，用D-Hanks液將細(xì)胞從骨髓腔中吹打出，經(jīng)離心后加入至含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，按3×106/cm2接種于6 cm的培養(yǎng)皿中。置于37℃的5%CO2飽和濕度為95%的CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。2 d后全量換液，以后每2～3 d更換一次培養(yǎng)基。細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化2～3 min，用全培養(yǎng)液終止消化，1000 r/min離心5 min，棄上清后用全培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞。每皿細(xì)胞重新接種到2個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)，進(jìn)行傳代擴(kuò)增純化。

1.4 MTT法測(cè)定細(xì)胞活性 分別用固態(tài)滅菌和液態(tài)滅菌兩種方法，各配制濃度為1%和5%及10%的海藻酸鈉凝膠鋪于96孔板底。取第3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mMSCs，制備單細(xì)胞懸液，按750個(gè)細(xì)胞/孔接種于鋪有海藻酸鈉凝膠并含完全培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板中。6 d內(nèi)每天進(jìn)行MTT試驗(yàn)。每孔細(xì)胞加入10 μl MTT(1 g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。離心去除培養(yǎng)液，加入二甲亞砜裂解細(xì)胞，570 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。以未加MTT孔為本底，其余孔的OD值扣除本底后均以該組未鋪凝膠孔為基準(zhǔn)換算成百分?jǐn)?shù)。

1.5 動(dòng)物及SCI模型 雄性ICR小鼠18只(購(gòu)自浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，體重(20±2)g。動(dòng)物隨機(jī)分成3組:移植組(SA-mMSCs組，n=6)，手術(shù)對(duì)照組(control組，n=6)以及假手術(shù)組(sham組，n=6)。SCI模型采用脊髓全橫斷方法制備。小鼠麻醉后手術(shù)，打開(kāi)椎板暴露T9-T10節(jié)段脊髓，在T9-T10脊髓節(jié)段之間切除一段脊髓，建立脊髓全橫斷損傷模型。移植組術(shù)后于椎管內(nèi)填充等劑量包裹有mMSCs的海藻酸鈉凝膠;手術(shù)對(duì)照組術(shù)后不填充任何物質(zhì);假手術(shù)組僅打開(kāi)椎板，不切斷脊髓。手術(shù)后給予定期排尿，每日1次腹腔注射青霉素抗感染。

1.6 行為學(xué)評(píng)分 實(shí)驗(yàn)小鼠分別在術(shù)后1、3、6、10、14 d進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分，采用Basso小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分法(Basso mouse scale，BMS)評(píng)價(jià)小鼠脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)情況。將小鼠放在曠場(chǎng)上，5 min內(nèi)觀察其爬行時(shí)臀、膝、踝關(guān)節(jié)、行走、軀干運(yùn)動(dòng)及其協(xié)調(diào)情況。評(píng)分在雙盲條件下進(jìn)行。

1.7 組織切片觀察 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于術(shù)后14 d處死，經(jīng)灌注固定后取出脊髓組織，分別經(jīng)固定及蔗糖梯度脫水后，行冰凍連續(xù)縱切片，片厚20 μm。脊髓組織切片用抗神經(jīng)絲(NF-200)進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果在熒光顯微鏡(尼康ECLIPSE 50i)下觀察。每張切片在鏡下(×200)隨機(jī)選取5個(gè)不同的視野拍照，采用自帶圖像分析軟件，計(jì)數(shù)每個(gè)視野中全部的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)取平均值。

2 結(jié)果

2.1 海藻酸鈉凝膠的制備 比較兩種溶劑配制的濃度分別為1%和5%及10%的海藻酸鈉凝膠的溶解度，發(fā)現(xiàn)隨著濃度增高，兩組凝膠的溶解度均下降，不同程度出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象;去離子水配制的海藻酸鈉凝膠，在各個(gè)濃度均較生理鹽水配制的凝膠有更好的溶解度，故選用去離子水作為本研究中海藻酸鈉的制備溶劑。

2.2 不同滅菌方法制備的海藻酸鈉凝膠對(duì)mMSCs活性的影響 分別將mMSCs培養(yǎng)于用液態(tài)滅菌和固態(tài)滅菌方法制備的海藻酸鈉凝膠上，連續(xù)6 d用MTT法測(cè)定細(xì)胞活性。各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性分別以未加海藻酸鈉凝膠孔為基準(zhǔn)換算成百分?jǐn)?shù)。與液態(tài)滅菌法相比，固態(tài)滅菌法配置的海藻酸鈉可以顯著提高mMSCs的細(xì)胞活性(P＜0.01)，這種促進(jìn)作用在培養(yǎng)第4天達(dá)到最大(P＜0.01)。而兩種方法配置的不同濃度的海藻酸鈉中，10%濃度均為最佳效應(yīng)濃度(表1)。

2.3 海藻酸鈉凝膠包被mMSCs移植對(duì)SCI小鼠行為學(xué)評(píng)分的影響 在小鼠脊髓全橫斷模型中，用固體滅菌法配置的濃度為10%的海藻酸鈉包被mMSCs填充斷端，該組小鼠從術(shù)后第6天起，2周內(nèi)的BMS評(píng)分均高于斷端未填充任何物質(zhì)的手術(shù)對(duì)照組(表2)。

表1 不同滅菌方法制備的海藻酸鈉凝膠對(duì)mMSCs活性的影響Table 1 The effect of sodium alginate gels prepared with different sterilization on the cell viability of mMSCs(n=10，)

表1 不同滅菌方法制備的海藻酸鈉凝膠對(duì)mMSCs活性的影響Table 1 The effect of sodium alginate gels prepared with different sterilization on the cell viability of mMSCs(n=10，)

與無(wú) SA 組比較，*:P ＜0.05，＊＊:P ＜0.01;與液態(tài)滅菌法處理比較，#:P ＜0.05，##:P ＜0.01.

固態(tài)滅菌法液態(tài)滅菌法時(shí)間點(diǎn) 無(wú)SA 1%SA 5%SA 10%SA 1 d 100.00 91.18 ±4.91 94.39 ±8.71 97.86 ±6.52 91 %SA 5%SA 10%SA 4.31 ±14.25 96.75 ±9.5 96.75 ±3.752 d 100.00 99.69 ±6.92 103.07 ±4.88 121.17 ±13.88*# 98.00 ±2.01 101.57 ±5.58 103.60 ±3.22*3 d 100.00 101.19 ±10.51 112.20 ±15.78 113.39 ±9.23* 98.00 ±3.55 100.97 ±2.18 105.13 ±2.38*4 d 100.00 224.37 ±17.62＊＊274.79 ±11.65＊＊ 289.08 ±11.83＊＊##97.86 ±12.12 104.55 ±13.65 105.80 ±9.015 d 100.00 185.61 ±16.52* 161.36 ±16.82* 256.82 ±10.40＊＊##109.24 ±14.12 124.42 ±16.47* 165.55 ±14.71＊＊6 d 100.00 96.00 ±3.74 100.86 ±3.42 104.31 ±5.00 96.00 ±11.39 101.09 ±17.48 100.61 ±14.56

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠BMS評(píng)分比較Table 2BMS score at different time points after SCI(n=6，)

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠BMS評(píng)分比較Table 2BMS score at different time points after SCI(n=6，)

與空白對(duì)照組比較，*:P＜0.05.

組別1 d 3 d 6 d 10 d 14 d空白對(duì)照 0.33 ±0.16 2.53 ±0.22 3.20 ±0.30 4.73 ±0.27 5.93 ±0.19 SA-mMSCs 0.37 ±0.12 3.27 ±0.54 4.20 ±0.42* 5.34 ±0.17* 7.33 ±0.38*假手術(shù) 8.12 ±0.37 8.20 ±0.43 8.27 ±0.22 8.23 ±0.35 8.24 ±0.25

2.4 免疫熒光染色結(jié)果 假手術(shù)組小鼠脊髓縱切片的灰質(zhì)部NF-200陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于其余2組，且細(xì)胞有較多突起，結(jié)構(gòu)有序。手術(shù)對(duì)照組的斷端附近結(jié)構(gòu)紊亂，灰質(zhì)部NF陽(yáng)性細(xì)胞減少，細(xì)胞形態(tài)異常。而SA-mMSCs組小鼠脊髓縱切片的NF陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于手術(shù)對(duì)照組(P＜0.01)，且組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)也較對(duì)照組有明顯改善(圖1)。

3 討論

海藻酸鈉是一類從褐藻中提取出的天然線性多糖，由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)通過(guò)1，4-糖苷鍵結(jié)合而成。海藻酸鈉較難溶于水，其粉末遇水變濕形成微粒，微粒迅速粘合在一起形成團(tuán)塊，后者緩慢水化并溶解。當(dāng)水中含有其它影響海藻酸鹽水合的化合物時(shí)，如水中的糖、淀粉或蛋白質(zhì)及濃度高于0.5%的單價(jià)陽(yáng)離子鹽，海藻酸鈉會(huì)更難溶解于水，故在配制溶液時(shí)需要延長(zhǎng)混合時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)比較了去離子水和生理鹽水兩種溶劑配制的海藻酸鈉凝膠的溶解性，發(fā)現(xiàn)生理鹽水單價(jià)陽(yáng)離子的存在的確增加了海藻酸鈉溶解的難度，當(dāng)濃度達(dá)到10%時(shí)出現(xiàn)沉淀。故本實(shí)驗(yàn)選用去離子水作為海藻酸鈉的溶劑。

海藻酸鈉自身帶有二價(jià)陰離子，在二價(jià)陽(yáng)離子存在條件下可交聯(lián)形成網(wǎng)狀水凝膠。該凝膠為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了三維空間，又因其具有很好的親水性，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)易于滲透擴(kuò)散，且其酶解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用，故非常適宜細(xì)胞生長(zhǎng)。因此，海藻酸鈉凝膠在組織工程研究中日益受到重視［4］。用于組織工程的材料在使用前都需要進(jìn)行滅菌處理，而海藻酸鈉是一種對(duì)熱敏感的多糖單鏈大分子，在溶液狀態(tài)下，加熱和照射都會(huì)導(dǎo)致分子鏈斷裂，以至于影響海藻酸鈉的理化性能［8］。李洪川等研究了不同的消毒方法對(duì)海藻酸鈉-明膠共混體的pH值、吸光度值和黏度的影響，發(fā)現(xiàn)固體高壓蒸汽滅菌法的影響相對(duì)較小，是較好的滅菌方法［9］。本實(shí)驗(yàn)在其研究基礎(chǔ)上，比較了液態(tài)高壓蒸汽滅菌法和固態(tài)高壓滅菌法制備的海藻酸鈉凝膠的pH值及其對(duì)MSCs的生物學(xué)性狀的不同影響。

圖1 術(shù)后2周各組小鼠脊髓組織NF-200陽(yáng)性細(xì)胞的比較Fig.1 Positive staining of NF-200 in spinal cord tissues 2 weeks after SCI

海藻酸鈉作為組織工程的載體，使細(xì)胞的生活狀態(tài)接近體內(nèi)狀態(tài)，有利于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的維持［10-11］。王嫣等觀察了海藻酸鈉對(duì)大鼠MSCs的生物學(xué)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)MSCs在海藻酸鈉凝膠中生長(zhǎng)良好，且向成骨細(xì)胞分化［5］。王海寶等將海藻酸鈉作為許旺細(xì)胞移植的載體用于脊髓損傷的治療，觀察到許旺細(xì)胞-海藻酸鈉凝膠移植能抑制大鼠脊髓損傷后脊髓細(xì)胞凋亡、促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)脊髓運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)［7］。為明確海藻酸鈉凝膠對(duì)mMSCs的生物學(xué)效應(yīng)，我們用兩種不同滅菌方法制備了1%、5%、10%三種濃度的海藻酸鈉凝膠，分別用作mMSCs的載體，以MTT法鑒定不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，固態(tài)高壓蒸汽滅菌法制備的海藻酸鈉凝膠pH值為7.21，與小鼠生理?xiàng)l件最為接近;同時(shí)，該法制備的凝膠可提高mMSCs的活性，且以濃度為10%最為明顯。故我們選擇用固態(tài)滅菌法制備的濃度為10%的海藻酸鈉凝膠作為mMSCs移植的載體，用于脊髓全橫斷模型的干細(xì)胞移植治療。

干細(xì)胞移植被認(rèn)為是脊髓損傷修復(fù)最有前景的治療手段［12］，研究發(fā)現(xiàn)SCI后移植MSCs，后者可通過(guò)抑制免疫反應(yīng)，分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，或分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)損傷脊髓修復(fù)和神經(jīng)功能恢復(fù)。但是干細(xì)胞移植過(guò)程中常需要合適的載體?；诤Ｔ逅徕c凝膠良好的生物相容性，較大的細(xì)胞載入量及我們觀察到的提高活性作用，我們用固態(tài)滅菌法配制濃度為10%的海藻酸鈉凝膠包被mMSCs，填充小鼠脊髓斷端，2周內(nèi)評(píng)價(jià)小鼠后肢的運(yùn)動(dòng)功能，并在組織切片上觀察神經(jīng)絲的表達(dá)情況。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未進(jìn)行移植治療的SCI組小鼠比，海藻酸鈉-mMSCs移植組小鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能明顯增強(qiáng)，與之對(duì)應(yīng)，其脊髓切片NF-200陽(yáng)性細(xì)胞明顯較未移植組多，且組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)有較顯著的改善。這些結(jié)果提示，用固態(tài)滅菌法制備的海藻酸鈉凝膠包被mMSCs不僅能在體外促進(jìn)細(xì)胞活性，還能在體內(nèi)改善mMSCs的生存環(huán)境，從而促進(jìn)損傷段神經(jīng)的再生，加速脊髓損傷的修復(fù)過(guò)程。

綜上所述，我們分別在細(xì)胞水平和動(dòng)物模型整體水平上，探討了不同方法制備的海藻酸鈉凝膠對(duì)mMSCs的生物學(xué)性狀的影響及其臨床應(yīng)用價(jià)值，結(jié)果表明，用固態(tài)高壓蒸汽滅菌法制備的海藻酸鈉凝膠能在體外促進(jìn)mMSCs的活性，將其作為干細(xì)胞的移植載體在小鼠脊髓損傷治療中有較好的療效，為臨床干細(xì)胞移植治療中細(xì)胞載體的選擇提供了實(shí)驗(yàn)參考。

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