馬勃菌絲體碳氮源利用的研究

孔 超 王麗華 宋愛(ài)榮

(山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,青島農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用真菌研究所,青島 266109)

馬勃 (puff-ball),俗稱牛屎菇或馬蹄包,隸屬擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycotina)、腹菌綱 (Gasteromycetes)、馬勃目(Lycoperdales)、馬勃科。馬勃種類(lèi)繁多,分布廣泛,在世界上大部分地區(qū)都有分布的記載。中國(guó)藥典 (2005年版)[1]收載的馬勃主要為脫皮馬勃 (Lasiosphoera fenzlii Reich),大馬勃[Calvatia gigantean(Batsch)Lloy]或紫色馬勃 [C.lilacina(Mont.et Berk.)Lloyd]的干燥子實(shí)體。此外還有黃硬皮馬勃、光硬皮馬勃和地形科、灰包科等數(shù)10種馬勃民間作為藥用。

馬勃為食藥兼用真菌,最早記載于 《名醫(yī)別錄》,味辛性平,入肺經(jīng),有消腫、止血、解毒等功效,用于消除咽喉腫痛及各種出血癥。李時(shí)珍的《本草綱目》中記載:“凡用以生布張開(kāi),將馬勃于上摩擦,下以盤(pán)承取末利用”。原為野生,現(xiàn)可進(jìn)行人工馴化栽培。

馬勃的化學(xué)成分包括甾體化合物[2]、萜類(lèi)化合物[3]、小分子含氮化合物、馬勃多糖[4]、蛋白質(zhì)、肽類(lèi)、生物堿[5]等。馬勃含有各種氨基酸[6],人體必需的8種氨基酸含量較高,特別富含賴氨酸、蛋氨酸,還含有馬勃素、無(wú)機(jī)鹽和微量元素等。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)驗(yàn)證,馬勃具有一定的藥理作用和臨床應(yīng)用價(jià)值。馬勃入藥部位為子實(shí)體,相關(guān)的藥理研究主要有以下幾個(gè)方面:抑菌作用[7]、抗炎作用[8]、止咳作用[9]、止血作用[10]、殺蟲(chóng)作用[11]、抗腫瘤細(xì)胞作用[12]、抗增殖[13]和抗細(xì)胞分裂活性[14]、變態(tài)反應(yīng)[15]、抗氧化作用[16]。

1 材料與方法

1.1 供試菌株 馬勃464菌株,山東省應(yīng)用真菌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 供試培養(yǎng)基 母種培養(yǎng)基 (馬鈴薯加富培養(yǎng)基):馬鈴薯20%、麩皮1%、蛋白胨0.5%、蔗糖2%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、瓊脂 2%、水1L。

碳源培養(yǎng)基:馬勃菌平板培養(yǎng)的碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為蔗糖2%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO40.05%、瓊脂2%、蒸餾水300 mL,pH自然。分別用葡萄糖、半乳糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖、玉米面、玉米淀粉、地瓜淀粉、馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉替換碳源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蔗糖,以不加碳源的培養(yǎng)基為對(duì)照。

氮源培養(yǎng)基:馬勃菌平板培養(yǎng)的氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為 (NH4)2SO40.5%、蔗糖 2%、KH2PO4 0.05%、MgSO40.05%、瓊脂2%、蒸餾水300 mL,pH 自 然。 分 別 用 NH4NO3、NaNO3、NH4Cl、NH4HCO3、NH4H2PO4、豆粉、麩皮、蛋白胨、尿素、玉米粉替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的 (NH4)2SO4,以不加氮源的培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.3 試驗(yàn)方法 馬勃菌固體平板培養(yǎng)法:按照無(wú)菌操作要求,挑取活化的菌種塊約0.5 cm2接種于固體平板中央,封口標(biāo)記。各處理設(shè)10個(gè)重復(fù),采用內(nèi)徑為12mm的打孔器定量取種,在平板中心接種,置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光靜置培養(yǎng)。從接種塊萌發(fā)時(shí)開(kāi)始記錄,待菌絲長(zhǎng)出原菌塊后,每天采用 “十字交叉法”測(cè)量菌落直徑,觀察菌絲生長(zhǎng)情況并記錄菌落特征。待處理組的菌絲體長(zhǎng)滿平板直徑時(shí),結(jié)束該處理組培養(yǎng)。記錄培養(yǎng)天數(shù)、菌絲生長(zhǎng)情況等,并進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬勃菌碳源利用的平板篩選

(1)不同碳源對(duì)馬勃菌絲體日均生長(zhǎng)量的效應(yīng)。從表1可以看出,3號(hào)以甘露醇為碳源的處理,對(duì)馬勃菌絲體日均生長(zhǎng)量的效應(yīng)明顯,日均生長(zhǎng)量為1.344 cm;其次是1號(hào)以玉米面為碳源的處理,日均生長(zhǎng)量為1.310 cm;9號(hào)以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基對(duì)馬勃菌絲體生長(zhǎng)效應(yīng)不明顯,日均生長(zhǎng)量?jī)H為0.292 cm。12號(hào)不加碳源為對(duì)照,盡管日均生長(zhǎng)量較大,為1.362 cm/天,但是菌絲體長(zhǎng)勢(shì)較差,表現(xiàn)為菌絲稀疏,灰白色,緊貼培養(yǎng)基。

從表1可以看出,可溶性淀粉培養(yǎng)基與其余碳源培養(yǎng)基存在極顯著差異 (1%水平),其他各處理間差異不顯著。

(2)不同碳源對(duì)馬勃菌絲體長(zhǎng)勢(shì)的影響。從表1可以看出,以玉米面、甘露醇作為碳源的處理1、3,菌絲長(zhǎng)勢(shì)好;測(cè)量結(jié)束幾天后繼續(xù)觀察,甘露醇菌絲體長(zhǎng)勢(shì)顯著優(yōu)于玉米面,表現(xiàn)為白色致密,絨氈狀,鋪滿整個(gè)平板;其次為以馬鈴薯淀粉、地瓜淀粉、乳糖為碳源的處理6、7、8;可溶性淀粉作為碳源的處理9馬勃菌絲體不生長(zhǎng)。

表1 不同碳源的馬勃菌絲體日均生長(zhǎng)量及菌絲生長(zhǎng)情況

在碳源試驗(yàn)中,以菌絲長(zhǎng)滿平板直徑為標(biāo)準(zhǔn),結(jié)束平板培養(yǎng)。觀察各處理的菌落形態(tài),其中,以麥芽糖、甘露醇處理的菌絲首先長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。

值得一提的是,本試驗(yàn)碳源培養(yǎng)基以蛋白胨作為氮源[17],因蛋白胨為復(fù)雜的天然有機(jī)物質(zhì),其中可能含有可充當(dāng)碳源的營(yíng)養(yǎng)成分,因此沒(méi)有添加其他碳源的空白對(duì)照組菌絲體生長(zhǎng)雖然稀疏,但仍較快。綜合分析菌體生長(zhǎng)速度和菌落形態(tài),馬勃菌絲體的單因子碳源試驗(yàn)結(jié)果以甘露醇為最佳。

2.2 馬勃菌氮源利用的平板篩選

(1)不同氮源對(duì)馬勃菌絲體日平均生長(zhǎng)量的效應(yīng)。從表2可以看出,11號(hào)以麩皮為氮源的處理,對(duì)馬勃菌絲體日均生長(zhǎng)量的效應(yīng)較大,日均生長(zhǎng)量為1.80625 cm;其次為12號(hào)以豆粉為氮源的處理、4號(hào)以NaNO3為氮源的處理,日均生長(zhǎng)量分別為1.7375 cm、1.6975 cm;而5號(hào)以NH4Cl為氮源的處理及1號(hào)以 (NH4)2SO4為氮源的處理對(duì)馬勃菌絲體日均生長(zhǎng)量的效應(yīng)較小,日均生長(zhǎng)量分別為0.41735 cm、0.39625 cm。13號(hào)不加氮源為對(duì)照,盡管日均生長(zhǎng)量 (1.70313 cm)較大,但是菌絲體長(zhǎng)勢(shì)較差,表現(xiàn)為菌絲體稀疏,白色,緊貼培養(yǎng)基。

各處理經(jīng)差異顯著性分析結(jié)果 (表2),以(NH4)2SO4作氮源的處理1與其他各處理存在顯著差異。

表2 不同氮源的馬勃菌絲體日均生長(zhǎng)量及菌絲生長(zhǎng)情況

(2)不同氮源對(duì)馬勃菌絲體生長(zhǎng)的效應(yīng)。從表2看出,以NaNO3、尿素為氮源的處理,馬勃菌絲體生長(zhǎng)情況較好。當(dāng)測(cè)量結(jié)束,繼續(xù)培養(yǎng)2天后觀察,發(fā)現(xiàn)后期NaNO3培養(yǎng)基菌絲體白色致密,絨氈狀,鋪滿整個(gè)平板;尿素為氮源的,表現(xiàn)為菌絲稀疏,并漸變?yōu)榛野咨?。其余氮源培養(yǎng)基仍表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢,菌絲顏色與前期沒(méi)有多大區(qū)別。

在氮源試驗(yàn)中,以菌絲長(zhǎng)滿平板直徑為標(biāo)準(zhǔn),結(jié)束平板培養(yǎng)。觀察各處理的菌落形態(tài),其中,以尿素、NaNO3處理的菌絲首先長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿。

馬勃平板培養(yǎng)特性氮源的選擇試驗(yàn)結(jié)果顯示,馬勃菌絲體以NaNO3作為氮源生長(zhǎng)得最好。差異顯著性分析的結(jié)果顯示,麩皮、豆粉、對(duì)照、NaNO3、玉米粉 、尿素 、蛋白胨 、NH4Cl、NH4HCO3、NH4NO3、酵母膏、NH4H2PO4、NH4Cl與(NH4)2SO4之間存在顯著差異(5%水平);但各處理間無(wú)極顯著差異(1%水平)。

3 討論

根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果,馬勃464菌株菌絲體生長(zhǎng)的最佳碳源為甘露醇,最佳氮源為NaNO3。在試驗(yàn)過(guò)程中,由于對(duì)接種菌齡一致性、接種時(shí)菌塊大小一致性和菌種接種部位的確定性等方面還會(huì)存在一些問(wèn)題,難免會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究是在單因子條件下測(cè)試的碳、氮營(yíng)養(yǎng)[18],而多因子的交互效應(yīng)尚需進(jìn)一步進(jìn)行研究;試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的系統(tǒng)性也有待于進(jìn)一步提高。

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