苦碟子對人臍靜脈血管內皮細胞株HUVEC 生長的影響*

彭乙華，曾恒禮，蔣 紅，蔡 燕，4，陳 敏，陳玉華，康后生，嚴宗遜

(1.川北醫學院附屬醫院內分泌科，四川 南充 637000;2.富順縣第三人民醫院急診科，四川 自貢 6432013;3.川北醫學院附屬醫院風濕免疫研究所，四川 南充 637000;4.川北醫學院附屬醫院檢驗科，四川 南充 637000)

糖尿病周圍神經病變［1］(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病患者致殘的重要原因，嚴重影響人類健康。故加強對糖尿病周圍神經病變的治療具有重要意義。中醫中藥治療糖尿病周圍神經病變歷史悠久，取得了一定的療效［2，3］，其中苦碟子注射液憑借其療效好、毒副作用低尤其受到臨床醫生的青睞，已廣泛用于治療糖尿病周圍神經病變，但其具體機制尚不明確，故本實驗以不同濃度的苦碟子注射液處理人臍靜脈血管內皮細胞株HUVEC，探討苦碟子治療DPN 的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細胞:人臍靜脈血管內皮細胞株HUVEC 由本院風濕免疫研究所保存。

1.1.2 試劑:RPMI1640 培養基(購自美國GIBCO);胎牛血清(購自杭州四季青公司)，使用濃度10%;MTT(購自美國sigma)，用0.1mol/L、pH 值為7.2 的磷酸鹽緩沖液配制為5mg/ml 于－20℃保存備用;DMSO 即二甲基亞砜(購自美國sigma);苦碟子注射液由本院藥房提供(10ml/支，通化華夏藥業有限責任公司生產，國藥準字Z20025450))，4℃保存備用，使用時以培養基稀釋。

1.1.3 儀器:酶標儀(美國BD-RAD model 680 型)。

1.2 方 法

1.2.1 細胞培養:人臍靜脈血管內皮細胞株HUVEC 細胞用RPMI1640 培養基(加有10%的胎牛血清和終濃度皆為100U/ml 的青霉素及鏈霉素)于37℃、5%CO2條件下培養，待細胞密度為90%左右時用0.25%胰酶消化細胞，按每孔1000 個細胞左右(每孔終體積200μl)傳代至96 孔微量反應板中繼續培養24 小時后進行后續實驗。

1.2.2 藥物分組:將苦碟子按終濃度不同分為0μl/ml、 3.125μl/ml、 6.25μl/ml、 12.5μl/ml、25μl/ml、50μl/ml、100μl/ml 共7 組，其中0μl/ml 組為陽性對照組，余6 組為實驗組。藥物以培養基稀釋，每組設6 個復孔，另設不含細胞和藥物的空白對照孔和不加細胞僅加藥物的對照孔(以排除藥物對實驗結果的干擾)。

1.2.3 MTT 檢測:觀察96 孔微量反應板中的細胞，24 小時后細胞基本貼壁，按以上分組情況加藥，小心吸取各培養孔中的培養液棄之。將含有不同濃度苦碟子注射液的培養液加至對應組中，繼續培養，分別于培養后24 小時、48 小時進行MTT 試驗:每孔加入5mg/ml 的MTT 溶液20μl，繼續培養4 小時，2000r/m 離心10 分鐘后小心吸取上清棄之，每孔加入DMSO 150μl，振蕩10 分鐘使結晶充分溶解，在酶標儀上于波長490nm 處檢測各組吸光度值(OD值)。

1.3 統計分析

2 結 果

培養24 小時和48 小時后檢測，各處理組細胞吸光度值明顯高于對照組(0μl/m l)細胞的吸光度值，提示苦碟子具有促進細胞增殖的作用，且隨藥物濃度增加促進作用逐漸增強(見圖1)。對同一時間點的各組細胞吸光度值進行單因素方差分析，差異有顯著性(p ＜0.05)(見表1)。

表1 不同濃度的苦碟子注射液處理HUVEC 細胞24 小時和48 小時后各組細胞吸光度值比較

3 討 論

糖尿病(diabetes，DM)是第三位威脅人類健康的重大非傳染性疾病，僅次于腫瘤、心腦血管疾病。我國目前約有3 千萬糖尿病患者，隨著經濟發展和生活方式的改變有增加趨勢。作為糖尿病最常見的慢性并發癥，DPN 的發生率高達60%-90%，主要臨床特征為肢體感覺和運動神經功能障礙，表現為肢體麻木、攣急疼痛、肌肉無力、腱反射減弱或消失等。并發難治性潰瘍、急慢性骨髓炎乃至敗血癥、肌肉萎縮和癱瘓、關節畸形等，病情遷延難愈，嚴重影響糖尿病病人生活質量，是糖尿病患者致殘的主要原因，故應加強對糖尿病周圍神經病變的治療。

目前研究發現DPN 的發病與機體代謝紊亂、維生素缺乏和微小血管病變引起的神經缺血、缺氧有關［4］。DPN 患者多存在周圍血管的堵塞和血流不暢，并且病變區域還存在側支血管的建立不足，從而影響病變部位神經、小血管和微血管的血液和營養供應。王海燕等［5］將消渴痛痹顆粒通過灌胃的方式處理DPN 模型大鼠，發現該中藥方劑能促進大鼠缺血組織的微血管再生，從而改善局部微循環障礙，減輕或改善了糖尿病周圍神經病變。提示促進血管再生、建立病變部位側支循環，以增加神經和小血管的養供是藥物治療DPN 的機制之一。

苦碟子注射液是從中藥苦碟子中提取的富含腺苷、黃酮、異黃酮的復方制劑，具有抗血小板聚集、擴張血管和改善微循環的作用。苦碟子可通過其疏通微循環的作用起到增加冠脈和腦血管血流量，在臨床上常用于治療不穩定性心絞痛［6，7］、心力衰竭［8］、腦梗死［9，10］、糖尿病腎病［11］等，并取得了一定的療效。研究者在臨床工作發現將苦碟子注射液與甲鈷胺聯用后可明顯改善糖尿病周圍神經病變患者的癥狀和體征，說明苦碟子是治療DPN 的有效藥物，但其作用機制尚不明確。本實驗結果顯示不同濃度的苦碟子注射液作用HUVEC24 小時和48 小時后，MTT 檢測其吸光度值明顯高于未加藥物的對照組(p ＜0.05)，說明苦碟子注射液具有促進HUVEC 增殖的作用。提示苦碟子注射液可能通過促進HUVEC 增殖，從而促進血管增生、側支循環建立，以改善病變部位血液供應，達到改善DPN 患者的癥狀和體征的作用。

［1］ 劉順國，初玲華.糖尿病周圍神經病變的研究進展［J］.大理學院學報，2006，5(2):79 －81

［2］ 彭乙華，嚴宗遜.中醫中藥治療糖尿病周圍神經病變研究進展［J］.中國醫藥導報，2011，8(1):11 －12

［3］ Stavniichuk R，Drel VR，Shevalye H，et al.Baicalein alleviates diabetic peripheral neuropathy through inhibition of oxidative-nitrosative stress and p38 MAPK activation［J］.Exp Neurol，2011，230(1):106 －113

［4］ 徐詠平，鄧康平，張木勛.糖尿病周圍血管病變對周圍神經病變的影響［J］.中國康復，2007，22(2):84 －87

［5］ 王海燕，張效科.消渴痛痹顆粒對DM 大鼠周圍神經缺血狀態新生血管的影響［J］.黑龍江中醫藥，2011，40(2):43 －44

［6］ 從偉成，陳 琳，劉新紅，等.苦碟子注射液治療不穩定性心絞痛30 例療效觀察［J］.河北中醫，2009，31(8):1207 －1209

［7］ 邢同國.苦碟子治療冠心病心絞痛的療效觀察［J］.中國現代醫療，2010，48(10):45 －46

［8］ 徐茂鳳，李永杰，代生厚，等.苦碟子對老年冠心病心力衰竭心功能的改善作用［J］.中國老年學雜志，2010，8(30):2362－2363

［9］ 鄭必龍，井 華.鹽酸丁喀洛爾聯合苦碟子治療腦梗死療效觀察［J］.中國現代藥物應用，2009，3(19):138

［10］ 顏 華，李 琴，蔡 潔.苦碟子治療腦梗死療效觀察［J］.中國社區醫師，2010，12(254):112 －113

［11］ 林海洋，毛小潔，陳恩福，等.苦碟子聯合前列地爾治療早期糖尿病腎病的療效觀察［J］.實用醫學雜志，2011，27(4):673－675