維生素E琥珀酸酯聯合紫杉醇對Her-2過表達乳腺癌細胞的誘導凋亡研究

趙妍 李里 姜秋穎 申維喜 武露艷 閻婷婷

哈爾濱醫科大學附屬第二醫院腫瘤內科，黑龍江 哈爾濱 150086

乳腺癌是危害女性健康的常見惡性腫瘤，其發病率占婦女腫瘤的31%，其中有10%～34%屬于Her-2基因過表達［1］。目前，紫杉醇已成為治療乳腺癌的有效藥物之一。研究證明，乳腺癌細胞中Her-2基因的過度表達降低了其對紫杉醇的敏感性［2-4］，Bcl-2蛋白是一種重要的細胞凋亡抑制蛋白，有研究報道，Bcl-2可使腫瘤細胞對紫杉醇產生抗藥性，相反降低細胞Bcl-2的水平可使細胞對紫杉醇敏感［5］。維生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)是天然維生素E的酯化衍生物，可誘導腫瘤細胞凋亡，卻對正常細胞組織沒有毒性作用［6］。研究報道VES作用于白血病細胞Raji、前列腺癌細胞后，Bcl-2蛋白表達下降［7-8］，本研究以VES、紫杉醇單獨及聯合作用于Her-2過表達乳腺癌細胞MDA-MB-453，通過檢測其誘導凋亡率，判斷VES對紫杉醇誘導Her-2過表達乳腺癌細胞MDA-MB-453的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

VES為Sigma公司產品；紫杉醇為百時美施貴寶公司產品；鼠抗人Her-2單抗、SP檢測試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司；TUNEL凋亡檢測試劑盒購自Roche公司(產品規格：20T，產品貨號：SK-9000)；流式細胞儀為哈爾濱醫科大學公衛學院提供。

1.2 細胞與細胞培養

人乳腺癌MDA-MB-453細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院；優級胎牛血清為杭州四季青公司產品；RPMI 1640培養基為北京賽默飛世爾生化制品有限公司產品。MDAMB-453細胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中于37 ℃、CO2體積分數為5%的條件下培養。

1.3 免疫細胞化學法檢測MDA-MB-453細胞株Her-2蛋白的表達

取對數生長期MDA-MB-453乳腺癌細胞株于離心管中離心(1 000 r/min，離心半徑為13.5 cm，5 min)，棄上清液，加中性甲醛固定(甲醛與細胞量之比為7∶1)后制備成石蠟切片，共制備5張切片，按照Her-2染色試劑盒操作步驟檢測表達率。

1.4 流式細胞儀檢測該細胞株的自身凋亡率及VES組和乙醇組MDA-MB-453細胞株的凋亡率

取對數生長期MDA-MB-453細胞，用RPMI 1640和10%FS培養液充分吹打使細胞混勻，細胞計數為71×104/mL，為達到2×106/mL的上機標準，于1 000 r/min離心5 min后去上清液，各加1 mL正常培養液充分吹打使細胞混勻后，吸出移至2個EP管中并分別標記為0和1，再離心棄上清液加PBS沖洗離心3次(1 000 r/min，離心半徑13.5 cm，5 min)，加 200 μL Binding Buffer，培養 36 h 后加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI輕混勻，避光反應10 min后追加300 μL Binding Buffer后上機。乙醇組除所用培養液為0.15%的乙醇+RPMI 1640+10%FS，其他操作同上。VES組除培養液為15 mg/L VES+ RPMI 1640+10%FS，其他操作同 上，以上步驟每組均重復3次。

1.5 TUNEL法檢測不同濃度的VES及不同濃度的紫杉醇分別單獨作用于MDA-MB-453細胞株的凋亡率

VES以0.15%的乙醇溶解，配制成濃度為10、20 mg/L的VES。取對數生長期的MDAMB-453細胞珠接種于96孔板中，細胞計數每孔約1×106個，加培養液至300 μL，分別用10、20 mg/L的 VES，50、100 nmol/L的 紫 杉醇處理MDA-MB-453細胞24、48 h后，參照TUNEL試劑盒染色檢測細胞凋亡，計算凋亡指數，凋亡指數(AI)=(凋亡細胞數/計數總細胞數)×100%。

1.6 TUNEL法檢測VES聯合紫杉醇作用于MDA-MB-453細胞株的凋亡率

VES聯合紫杉醇作用于MDA-MB-453細胞， 共8組， 第1組：VES 10 mg/L， 紫 杉醇50 nmol/L，作用時間24 h；第2組VES 10 mg/L，紫杉醇50 nmol/L，作用時間48 h；第3組VES 10 mg/L，紫杉醇100 nmol/L，作用時間24 h；第4組：VES 10 mg/L，紫杉醇100 nmol/L， 作 用 時 間 48 h；第 5組：VES 20 mg/L，紫杉醇50 nmol/L，作用時間24 h；第 6組：VES 20 mg/L， 紫 杉 醇 50 nmol/L，作用時間48 h；第7組：VES 20 mg/L，紫杉醇100 nmol/L，作用時間24 h；第8組：VES 20 mg/L，紫杉醇100 nmol/L，作用時間48 h；各組藥物分別作用于MDA-MB-453細胞，參照TUNEL試劑盒染色檢測細胞凋亡，計算凋亡指數。

1.7 統計學處理

采用SPSS 10.0軟件進行統計學分析，顯著性比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 免疫細胞化學法檢測乳腺癌細胞MDAMB-453的Her-2表達水平

5張切片Her-2蛋白表達率分別為65.30%、68.67%、63.64%、65.12% 和69.57%，其95%CI：63.32%～69.60%，進一步驗證了MDA-MB-453細胞為Her-2蛋白過表達乳腺癌細胞(圖1)。

2.2 MDA-MB-453細胞株的自身凋亡率及VES組和乙醇組作用于該細胞株的凋亡率

MDA-MB-453細胞的自身凋亡率為2.1%。0.15%的乙醇作用于MDA-MB-453細胞株36 h后的凋亡率為2.4%。15 mg/L的 VES作用于MDA-MB-453細胞株36 h后的凋亡率為9%。和空白對照組相比，乙醇組凋亡率改變不明顯(P＞0.05)，VES 組凋亡明顯 (P＜0.05)。

2.3 VES和紫杉醇單獨作用以及聯合作用于MDA-MB-453細胞的凋亡率

VES單獨作用可誘導Her-2過表達乳腺癌細胞凋亡，并成劑量和時間依賴關系；紫杉醇單獨作用誘導Her-2蛋白過表達乳腺癌細胞凋亡呈劑量和時間依賴關系(表1)。

VES和紫杉醇聯合作用的TUNL染色結果見圖2，根據染色結果計算凋亡指數，可見VES聯合紫杉醇作用于Her-2過表達乳腺癌細胞后，對細胞增殖的抑制作用較兩藥單藥作用時明顯增強，具有統計學意義(P＜0.05，表1)。但這種誘導凋亡作用不成劑量和時間依賴關系，其中以10 mg/L的 VES聯合100 nmol/L的紫杉醇作用時間為48 h對MDA-MB-453細胞的誘導凋亡作用最強。

表 1 兩種藥物單獨及聯合對Her-2過表達乳腺癌細胞的誘導凋亡率Tab.1 The induction of apoptosis by the two drugs in breast cancer cells

3 討 論

乳腺癌是危害女性健康的常見惡性腫瘤，其發病率占婦女腫瘤的31%，目前的治療手段基本可以使患者獲得較高的生存率。紫杉醇是治療乳腺癌的有效藥物之一，其機制主要是促進微管聚合和穩定已聚合微管，將細胞阻滯于G2/M期，抑制腫瘤細胞的遷移，激活免疫細胞等對乳腺癌細胞進行殺傷［9-10］。然而，約有30%的乳腺癌患者為Her-2基因過表達，研究表明其對化療藥物存在明顯耐藥，常導致化療失?。?1］。Ciardiello等［12］也已證明Her-2基因過表達的乳腺癌細胞對紫杉醇的敏感性下降，為了提高紫杉醇的療效，可以尋找一些紫杉醇化療增敏的途徑。

VES可使腫瘤細胞阻滯于G1期，對惡性腫瘤細胞有特異性的生長抑制作用，卻對正常細胞組織沒有毒性作用。研究表明，VES對乳腺癌、前列腺癌、舌癌及腎癌等惡性腫瘤均具有顯著的誘導凋亡作用［13-16］。經證實，VES在體外誘導乳腺癌細胞凋亡，在體內對荷乳腺癌小鼠有抑瘤作用［17-18］。

本實驗用免疫細胞化學法驗證了MDAMB-453乳腺癌細胞為Her-2蛋白過表達乳腺癌細胞，以50、100 nmol/L的紫杉醇作用于MDA-MB-453細胞24、48 h后的誘導凋亡率分別為：15.3%、17.9%、23.5%和29.3%。以10和20 mg/L的VES作用于MDA-MB-453細胞24、48 h后的凋亡率分別為13.6%、16.28%、45.5%和48.84%。說明紫杉醇和VES對Her-2蛋白過表達乳腺癌細胞MDA-MB-453均有誘導凋亡作用，這種作用成濃度和時間依賴關系。本研究再以兩藥聯合作用于MDAMB-453細胞，結果表明兩藥聯合的誘導凋亡率明顯高于單藥，并證實兩藥有協同作用(P＜0.05)，隨著對VES的深入研究，其有望成為紫杉醇化療藥物發揮療效的增敏劑。

已證實 Bcl-2蛋白是一種重要的細胞凋亡抑制蛋白，定位于線粒體內膜、內質網膜及核膜上。有報道，Bcl-2可使細胞對紫杉醇產生抗藥性，相反降低Bcl-2的水平可使細胞對紫杉醇敏感，表明Bcl-2水平與細胞對紫杉醇的耐藥直接相關。研究證明VES作用于白血病細胞Raji、前列腺癌細胞后，Bcl-2蛋白表達下降，本實驗VES作用于MDA-MB-453細胞有可能通過降低Bcl-2的水平使腫瘤細胞對紫杉醇敏感而產生協同作用。此外，紫杉醇將細胞阻滯于G2/M期，VES可使腫瘤細胞阻滯于G1期，協同作用有可能與兩種藥物作用于細胞的不同周期有關。但具體機制需要下一步研究。

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