上皮-間葉轉變相關蛋白在非小細胞肺癌中的表達及其預后意義

石永利 吳鴻雁 樊祥山 張明逸 葉慶 馮振卿*

1.南京醫科大學病理學系，江蘇 南京 210008；

2.南京市鼓樓醫院病理科，江蘇 南京 210008

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是國內致死率最高的惡性腫瘤。其主要治療手段是手術切除結合手術后放療和化療［1］。目前已經通過檢測一些相關分子標志物的表達情況來反映腫瘤的分化、增殖程度等，以指導臨床治療［2］。然而腫瘤的復發和轉移通常是NSCLC患者死亡的主要原因，因此研究與腫瘤轉移相關的分子標志物能夠更好地判斷患者的預后情況，為NSCLC患者的分子靶向治療提供新思路［1］。研究發現上皮-間葉轉變(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)是腫瘤發生侵襲、轉移的一個重要原因［3-4］。本研究采用組織芯片技術和免疫組織化學方法，檢測EMT相關蛋白Snail、Vimentin、E-cadherin和β-catenin在NSCLC中的表達情況，分析其表達與NSCLC患者臨床病理參數及預后的關系。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

從南京市鼓樓醫院病理科選取2006年—2008年間石蠟包埋的NSCLC患者腫瘤組織標本165例，患者中男性115例，女性50例；年齡36～83歲，中位年齡62歲。患者術前均未接受放療和化療。按照2009年WHO肺癌組織學分類及分級標準，其中腺癌107例，鱗癌58例；中高分化117例，低分化48例；TNM分期Ⅰ期64例，Ⅱ期39例，Ⅲ期57例，Ⅳ期5例。患者具有完整的隨訪資料。

1.2 方法

1.2.1 分組

依據Snail、Vimentin、E-cadherin/β-catenin復合體的異常表達情況對患者進行分組：組1(均無異常)、組2(僅1種異常)、組3(2種異常)和組4(3種異常)，繼續分為：EMT-L1組(1～2種異常)和EMT-L2組(3～4種異常)。

1.2.2 組織芯片的制備

復習所有患者的全部HE切片，確定有代表性的病變部位并在相應的蠟塊上做好標記。應用組織微陣列打孔儀(購自美國Beecher instrument公司)在1個空白蠟塊(28 mm×22 mm×15 mm)上打孔(孔直徑1 mm，長4 mm)，然后在蠟塊的標記部位穿刺與孔大小相同的蠟柱，準確放入空白蠟塊的小孔中，依次按序操作。設計的組織陣列為14×11陣列。每個病例重復取點3次，以獲得較好的代表性。制作完成的組織芯片蠟塊4 μm連續切片50張，置于-20 ℃儲存。

1.2.3 免疫組織化學染色

Snail兔抗人多克隆抗體購自Abcam公司，工作濃度為1∶500。E-cadherin、β-catenin鼠抗人單克隆抗體均購自Zymed公司，工作濃度分別為1∶200和1∶150。Vimentin鼠抗人單克隆抗體購自Dako公司，工作濃度為1∶400。依照EnVision試劑盒說明書行免疫組織化學染色。PBS代替一抗作陰性對照。

1.2.4 結果判定

由2名 富有經驗的病理醫師通過雙盲法獨立評估。按腫瘤細胞染色強度進行評分：無色為0；淡黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。按腫瘤細胞陽性百分比評分：0為陰性；＜10%為1分；11%～50%為2分；51%～80%為3分；＞80%為4分。按照染色強度評分與陽性細胞百分比評分的乘積決定最終染色結果：其中0～3分為陰性(-)，4～12分為陽性(+)［5］。

1.3 統計學處理

所有數據采用SPSS 11.0統計軟件包處理。采用χ2檢驗、Spearman相關分析等統計學方法。患者的生存數據進行Kaplan-Meier分析，并繪制生存曲線圖，應用Log-rank檢驗差異性。建立Cox回歸模型，對預后因子進行多因素分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Snail、Vimentin、E-cadherin和β-catenin的表達及其與臨床病理參數的關系

Snail是一種轉錄因子，以細胞核出現棕黃色染色為陽性(圖1A)。Vimentin表達于間葉細胞的細胞質中，上皮細胞陰性。陽性結果為腫瘤細胞的細胞質內出現棕黃色著色(圖1B)。E-cadherin與β-catenin表達于上皮細胞的細胞膜，在細胞表面形成復合物，維持細胞間的粘附功能，但在一些患者的腫瘤細胞膜上表達下調或者轉位至細胞核(圖1C、D)。在165例癌組織中，Snail、Vimentin、E-cadherin和β-catenin的陽性例數分別為75(45.5%)、56(33.9%)、110(66.7%)和84(50.9%)。65(39.4%)例患者同時呈E-cadherin和β-catenin陽性表達，表明E-cadherin/β-catenin復合體完整。Snail的表達與E-cadherin的水平呈負相關(P＜0.001)，E-cadherin的表達與β-catenin呈正相關(P=0.003，表1)。Vimentin、E-cadherin和β-catenin的表達與患者年齡、性別、組織學類型、TNM分期無明顯相關性。Snail的表達與腫瘤的分化有關，低分化的NSCLC患者Snail的陽性率高于中高分化的NSCLC患者，差異有統計學意義(P=0.013)。

2.2 Snail、Vimentin及E-cadherin/β-catenin復合體的表達與患者預后的關系

165例NSCLC患者的平均生存時間為28個月，3年生存率為41.9%。Kaplan-Meier生存分析顯示，Snail、Vimentin陽性組的總生存期顯著短于陰性組(P=0.005 9、P=0.025 7，表2)。E-cadherin/β-catenin復合體不完整組(E-cadherin和β-catenin的表達至少1個陰性)的總生存期顯著短于完整組(E-cadherin和β-catenin的表達同時陽性，P=0.0025，表2)。

生存分析顯示，組1和組2患者之間的生存期無顯著差異，但兩組患者的生存期顯著短于組3和組4的患者，說明Snail、Vimentin及E-cadherin/β-catenin復合體其中任意2種表達異常或者3種表達異常組的總生存期顯著短于無異常或僅有1個異常表達組(圖2)。EMT-L2組的患者與EMT-L1組相比腫瘤的分化程度相對較差，差異具有統計學意義(P=0.003)。生存分析結果顯示，EMT-L2組患者的生存期顯著短于EMT-L1組的患者(P＜0.000 1，圖3A)。以此因素以及表2中患者性別、分化程度、腫塊最大徑、TNM分期及神經侵襲為獨立變量進行Cox回歸多因素分析。結果顯示，TNM分期、腫塊最大徑、EMT-L是獨立的風險預后因子(表3)。在Ⅰ期NSCLC(n=64)患者中，EMT-L2組(n=24)的總生存率顯著低于EMT-L1組(n=40，P=0.0244，圖3B)，Cox多因素分析顯示差異具有統計學意義(HR=0.318；95%CI=0.116～0.867；P=0.025)。

表 1 NSCLC患者體內Snail、Vimentin、E-cadherin和β-catenin表達的相關性Tab.1 Correlation between Snail, Vimentin, E-cadherin and β-catenin expression in patients with NSCLC

表 2 165例NSCLC患者總生存期的單因素分析Tab.2 Univariate analysis for overall survivals of 165 patients with NSCLC

表 3 165例NSCLC患者總生存期的多因素分析Tab.3 Multivariate analysis for overall survivals of 165 NSCLC patients

3 討 論

EMT是指細胞由上皮表型向間葉表型轉變的過程，其重要方面之一是丟失上皮標志物，例如c ytokeratin、E-cadherin和β-catenin等。E-cadherin是上皮細胞表面的黏附分子，對于細胞之間的黏附起到重要的作用，其下調是EMT的重要特征之一。β-catenin在細胞膜上與E-cadherin形成復合體，共同參與細胞之間的黏附作用。E-cadherin、β-catenin的表達下調常使細胞之間的黏附能力下降，轉移和侵襲能力增強。在多種腫瘤組織中如結腸癌、肺癌等也發現E-cadherin/β-catenin復合體的破壞，與腫瘤的復發和轉移密切相關［6-9］。本研究165例NSCLC患者，E-cadherin/β-catenin復合體在65例(39.4%)患者中完整存在。E-cadherin/β-catenin復合體不完整組的總生存期顯著短于完整組，表明E-cadherin/β-catenin復合體完整的患者預后較好。

EMT的另外一個重要方面是間葉標記的表達，如間葉細胞表面標志物Vimentin和調節間葉細胞分化的核轉錄因子Snail、S-100A4等。許多研究顯示，間葉蛋白的表達與腫瘤的分化程度以及細胞侵襲的表現型和腫瘤患者生存期縮短相關［10-13］。Snail的表達可以增加乳腺腫瘤細胞的侵襲性，在乳腺癌中其高表達與腫瘤的低分化和患者生存期縮短相關［11］。過表達Snail使胰腺腫瘤細胞的轉移和侵襲能力增強，將過表達Snail的胰腺腫瘤細胞注射入小鼠體內，發現腫瘤的轉移能力明顯增強［14］。Snail、Vimentin陽性組的總生存期顯著短于陰性組。Snail或者Vimentin陽性的患者的預后較差，說明Snail、Vimentin異常表達的患者常常在術后易發生腫瘤復發和轉移，生存時間較短。本研究中Snail與腫瘤的分化程度相關，中高分化的腫瘤Snail高表達，低分化的腫瘤Snail表達相對較低，這表明Snail可能在NSCLC的發生中起重要作用。

Snail的表達與E-cadherin的表達呈負相關。Snail是一種核轉錄因子，通過與E-cadherin啟動子的結合而抑制E-cadherin的表達［15］。E-cadherin的表達與β-catenin呈正相關，β-catenin的膜丟失常伴隨著E-cadherin表達的降低。原因可能是當E-cadherin丟失，E-cadherin/β-catenin復合體遭到破壞，β-catenin由細胞膜的定位轉移至細胞核中，發揮轉錄因子的作用，調節與EMT相關蛋白的表達［16］。

目前許多研究已經報道了采用一些分子標志物能夠判斷NSCLC患者的預后和生存情況［17-18］。但是將與轉移相關的一些分子標志物聯合起來，用來判斷NSCLC患者的預后和生存情況的研究還很少。Snail、Vimentin及E-cadherin/β-catenin復合體的異常表達是EMT過程中的重要變化，在多種腫瘤中表達異常與患者的預后有著密切的關系。本研究顯示，Snail、Vimentin及E-cadherin/β-catenin復合體EMT異常表達與NSCLC患者生存期短相關。根據每個患者這3種蛋白的改變情況，將患者分為EMT-L1組與EMT-L2組，EMT-L2組患者與EMT-L1組患者相比，其分化程度相對較低，說明當EMT的水平越升高時，不僅使細胞之間的黏附性下降，同時對于腫瘤組織的分化程度也有一定的影響。生存分析結果顯示，EMT-L2組患者的總生存期顯著短于EMT-L1組。此因素與TNM分期和腫瘤最大徑是獨立的預后因素，因此根據患者這3種與轉移相關的蛋白的異常表達情況，能夠對患者的生存情況做出判斷，這3種蛋白中任意2種蛋白表達異常時患者的預后較差。晚期的NSCLC在手術后要接受化療，然而早期NSCLC的化療仍然存在爭議［19］。本研究也分析了此分組在Ⅰ期NSCLC患者中判斷患者生存期的作用。在Ⅰ期NSCLC患者中，EMT-L2組患者的總生存期顯著短于EMT-L1組患者。因此這3種蛋白的異常表達情況對手術后Ⅰ期NSCLC患者的治療具有指導意義。

綜上所述，Snail、Vimentin和E-cadherin/β-catenin復合體在NSCLC中的異常表達與患者的生存期相關。任何2種或2種以上蛋白的異常表達提示預后相對較差，是NSCLC獨立的風險預后因子，這對于NSCLC患者的治療方式和預后判斷具有重要的參考價值。

［1］SUGIMURA H, NICHOLS F C, YANG P, et al.Survival after recurrent non-small cell lung cancer after complete pulmonary resection［J］.Ann Thorac Surg, 2007, 83(2): 409-417.

［2］D’AMICO T A.Molecular biologic staging of lung cancer［J］.Ann Thorac Surg, 2008, 85(2): 737-742.

［3］KLYMKOWSKY M W, SAVAGNER P.Epithelialmesenchymal transition: a cancer researcher's conceptual friend and foe［J］.Am J Pathol, 2009, 174(5): 1588-1593.

［4］GUPTA G P, MASSAGUE J.Cancer metastasis: building a framework［J］.Cell, 2006, 127(4): 679-695.

［5］ENGELS K, KNAUER S K, METZLER D, et al.Dynamic intracellular survivin in oral squamous cell carcinoma:underlying molecular mechanism and potential as an early prognostic marker［J］.J Pathol, 2007, 211(5): 532-540.

［6］BAUMGART E, COHEN M S, SILVA NETO B, et al.Identification and prognostic significance of an epithelialmesenchymal transition expression profile in human bladder tumors［J］.Clin Cancer Res, 2007, 13(6): 1685-1694.

［7］AAMODT R, BONDI J, ANDERSEN S N, et al.The prognostic impact of protein expression of E-cadherin-catenin complexes differs between rectal and colon carcinoma ［J］.Gastroenterol Res Pract, 2010［Epub 2010 Aug 16］.

［8］KANG H, MIN B S, LEE K Y, et al.Loss of E-cadherin and MUC2 expressions correlated with poor survival in patients with stages Ⅱ and Ⅲ colorectal carcinoma［J］.Ann Surg Oncol, 2010, 18(3): 711-719.

［9］CHELIDONIS G, KAVANTZAS N, PATSOURIS E, et al.DNA ploidy, E-cadherin, beta-catenin expression and their clinicopathologic significance in imprints of non-small cell lung cancer［J］.Anal Quant Cytol Histol, 2009, 31(5): 332-339.

［10］GALVAN J A, GONZALEZ M V, CRESPO G, et al.Snail nuclear expression parallels higher malignancy potential in neuroendocrine lung tumors［J］.Lung Cancer, 2010, 69(3):289-295.

［11］MOODY S E, PEREZ D, PAN T C, et al.The transcriptional repressor Snail promotes mammary tumor recurrence［J］.Cancer Cell, 2005, 8(3): 197-209.

［12］WILLIPINSKI-STAPELFELDT B, RIETHDORF S,ASSMANN V, et al.Changes in cytoskeletal protein composition indicative of an epithelial-mesenchymal transition in human micrometastatic and primary breast carcinoma cells［J］.Clin Cancer Res, 2005, 11(22): 8006-8014.

［13］LASCOMBE I, CLAIROTTE A, FAUCONNET S, et al.N-cadherin as a novel prognostic marker of progression in superficial urothelial tumors［J］.Clin Cancer Res, 2006,12(9): 2780-2787.

［14］NISHIOKA R, ITOH S, GUI T, et al.SNAIL induces epithelial-to-mesenchymal transition in a human pancreatic cancer cell line (BxPC3) and promotes distant metastasis and invasiveness in vivo［J］.Exp Mol Pathol, 2010, 89(2): 149-157.

［15］CASTRO ALVES C, ROSIVATZ E, SCHOTT C, et al.Slug is overexpressed in gastric carcinomas and may act synergistically with SIP1 and Snail in the down-regulation of E-cadherin［J］.J Pathol, 2007, 211(5): 507-515.

［16］STEMMER V, DE CRAENE B, BERX G, et al.Snail promotes Wnt target gene expression and interacts with beta-catenin［J］.Oncogene, 2008, 27(37): 5075-5080.

［17］SINGHAL S, VACHANI A, ANTIN-OZERKIS D, et al.Prognostic implications of cell cycle, apoptosis, and angiogenesis biomarkers in non-small cell lung cancer: a review［J］.Clin Cancer Res, 2005, 11(11): 3974-3986.

［18］LAU S K, BOUTROS P C, PINTILIE M, et al.Three gene prognostic classifier for early-stage non-small cell lung cancer［J］.J Clin Oncol, 2007, 25(35): 5562-5569.

［19］STRAUSS G M, HERNDON J E Ⅱ, MADDAUS M A, et al.Adjuvant paclitaxel plus carboplatin compared with observation in stage ⅠBnon-small cell lung cancer: CALGB 9633 with the Cancer and Leukemia Group B, Radiation Therapy Oncology Group, and North Central Cancer Treatment Group Study Groups［J］.J Clin Oncol, 2008, 26(31): 5043-5051.