脂聯素基因突變-11377C/G檢測方法建立及與2型糖尿病關系的研究

裴 林,喬博明,賈 玫*,張 旗

(北京大學人民醫院 1.檢驗科;2.中心實驗室,北京100044)

脂聯素(adiponectin,APN)是新發現的一種脂肪細胞表達的細胞因子,與肥胖、胰島素抵抗(IR)、2型糖尿病(T2DM)等疾病密切相關[1-3]。編碼人脂聯素的基因為aPM1,位于染色體3q27,由3個外顯子和2個內含子組成。全基因組寬帶掃描顯示該區域存在T2DM和代謝綜合征的易感位點[4-7],提示aPM1多態性與T2DM可能存在相關性。目前,已發現10余個脂聯素基因單核苷酸多態性(SNPs)位點及一些罕見的錯義突變。有研究認為,啟動子區域的SNPs、SNP+45及SNP+276和部分錯義突變與2型糖尿病和(或)胰島素抵抗存在相關關系,這種相關性主要由于突變影響了脂聯素的表達水平及其功能。

近年來國外研究發現aPM1啟動子區域存在-11377C/G多態性,并證實該多態性與肥胖、胰島素抵抗和T2DM有關。本研究旨在建立ARMS-TaqMan檢測aPM1-11377C/G多態性方法并探討血清脂聯素水平及aPM1-11377C/G多態性與T2DM的相關性。

1 資料與方法

1.1 對象

來源于2009年1月至2009年12月我院內分泌科住院患者及我院健康體檢者。分為糖尿病組(T2DM)和對照組(NC)。 ①T2DM 組:156人(男87/女69),依照1999年WHO糖尿病診斷標準[8]。②NC組:89例(男21/女 68),空腹血糖(FBG)＜6.1 mmol/L,無糖尿病史。

1.2 方法

1.2.1 測定身高、體重、計算體重指數,測定腰圍、臀圍,計算腰臀比。

1.2.2 血液生化指標的測定 血清脂聯素水平檢測方法為ELISA法,由美國RD system公司提供。空腹胰島素(FINS)和餐后2 h胰島素(PINS)測定使用羅氏2010型電化學發光儀,所用試劑由羅氏公司提供。總膽固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、空腹血糖(FBG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋

白膽固醇(LDL-C)測定使用日立7170全自動生化分析儀,所用試劑由日本和光公司提供。HbA1C測定使用高壓液相親和層析法,所用試劑由美國Primus公司提供。

1.2.3 人全血標本基因組DNA的提取 采用日本東洋紡(TOYOBO)磁珠法提取,采用EDTA-K2抗凝新鮮全血標本,提取基因組DNA標本-80℃保存備用。

1.2.4 人aPM1-11377C/G點突變不同基因型質粒標準品的獲取 等位基因野生型質粒標準品:上游引物 5′AGAACCGGCTCAGATCCTGTC3′;下游引物 5′GTGTGGGGCTTGGCAAGTTAA3′(上海生工)。PCR擴增產物與pGM-T載體(北京天根)連接后轉化到DH5α大腸桿菌進行克隆,提取質粒經測序確定后作為等位基因野生型質粒標準品。等位基因突變型質粒 標 準 品:上 游 引 物 5′AGAACCGGCTCAGATCCTGTG3′;下 游 引 物 5′AGCAGCCTGGAGAACTGGAAG3′,其余同上。等位基因雜合型質粒標準品:將等量野生型和純合突變型質粒標準品混合作為等位基因雜合型質粒標準品。對不同基因型質粒標準品配制成5×107copies/ml,-80℃保存備用。

1.2.5 引物及TaqMan探針設計 引物設計采用Primer Premier5.0軟件,由上海生工合成,北京賽百盛合成TaqMan探針。-11377C/G點突變擴增片段長度139 bp,野生和突變上游引物3′端-2位引入錯配堿基”T”(正配堿基應為”C”)。TaqMan探針與上游引物擴增的模板鏈互補。TaqMan探針5′端標記熒光報告基團FAM,3′端標記淬滅基團TAMRA(表1)。

表1 ARMS-TaqMan方法檢測aPM1基因C-11377G點突變引物及探針序列表

1.2.6 ARMS-TaqMan方法反應體系及測定條件反應體系 25 μ l,包括 2.5 ×RealMasterMix 10 μ l,上 、下游引物各 0.4 μ M,TaqMan prob 0.8 μ M,模板 2.5 μ l,使用 BIO-RAD Opticon 2熒光定量PCR儀檢測TaqMan探針FAM熒光信號。反應條件94℃10 min,94℃30 sec,60℃60 sec,40個循環。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 組間生化指標比較 見表2。

表2 T2DM組和對照組間基本資料比較(x—±s)

2.2 基因型分組臨床資料比較 見表3。

表3 基因型分組臨床資料比較(x—±s)

2.3 aPM1-11377C/G點突變CC、CG、GG 三種基因型APN水平比較 245例調查對象中,共檢測到GG、CG、CC 基因型分別為11例 、88例和 146例,單因素方差分析顯示,從CC、CG、GG基因型的APN水平呈趨勢性降低(9.72±5.52 mg/L,6.86±4.00 mg/L,4.29±2.18 mg/L,P＜0.001)。

2.4 ARMS-TaqMan方法檢測aPM1-11377C/G點突變 見圖1。分別顯示不同質粒標準品在5×107copies/ml濃度時不同引物對不同基因型的循環閾值(CT值)變化情況。由圖中可見,根據有無指數擴增期及CT值,可明確將CC、CG、GG三種基因型進行區分。

2.5 T2DM組和對照組aPM1-11377C/G基因型及等位基因頻率比較 見表4。

圖1 aPM1-11377 C/G點突變不同等位基因質粒標準品型熒光定量PCR擴增曲線圖(5×107copies/ml)

表4 T2DM組和對照組aPM1-11377C/G基因型及等位基因頻率比較

3 討論

目前檢測SNP的方法有單鏈構象多態性分析(PCR-SSCP)、限制性片段長度多態性分析(PCRRFLP)和變性高效液相色譜分析(DHPLC)等,但PCR-SSCP重復性較差;PCR-RFLP只能對含有酶切位點的SNP進行分型,而aPM1在-11377位點附近無酶切位點;DHPLC不能確定SNP的位置和類型,且只能檢測雜合突變,故本研究未選用上述方法。

ARMS-PCR的測定原理是基于錯配出現在引物3′端時,引物將不能延伸。為了增加擴增特異性,本研究還在引物3′端-2位引入了錯配堿基T。擴增產物經測序確定,準確性和特異性均較高。本研究通過對野生型和突變型基因進行質粒連接、轉化、增菌、提取質粒、測序確定等步驟,獲得了 aPM1-11377C/G野生型和突變型質粒標準品,為進一步檢測臨床標本提供了質量保證。

本研究所用ARMS-TaqMan PCR技術,通過對引物3′端正配與錯配的擴增效率差異的比較鑒定SNP,且可以定量檢測。該技術準確度高,適合樣本多、位點數量少的檢測。采用本方法檢測 aPM1 SNP,國內尚無人采用。與上述方法比較,該方法靈敏、簡便,重復性好,交叉污染少,易于自動化,由于本研究獲得了人aPM1-11377C/G點突變不同基因型質粒標準品,故可應用于臨床,為今后的定量檢測奠定了基礎。

本文研究顯示aPM1-11377C/G突變對糖脂代謝均有影響,T2DM組血清脂聯素水平低于對照組(P=0.019),與 Weyer、Pellme 和 Daimon[9-11]的研究結果相符。而Looker等[12]在對有T2DM的Pima印地安人所做的研究表明,在血糖調節受損或糖尿病病程＜10年的患者中最低,在糖耐量正常或糖尿病病程至少10年的患者中最高,提示T2DM患者血清脂聯素水平與病程相關,而病程大于10年的患者血清脂聯素水平不降反升,可能與糖尿病腎臟損害,引起腎小球濾過率下降,進而引起脂聯素排泄障礙有關,具體機理有待進一步研究。

本研究顯示aPM1-11377C/G基因多態性與T2DM發生相關,G等位基因頻率百分比與T2DM呈正相關。對照組和T2DM組apM1-11377C/G基因多態性發生頻率分別為19.11%和24.36%,該頻率與日本人報道一致[13],與德國人[14]和瑞士高加索人[15]不同,說明該位點存在一定的種族差異性。

綜上所述,aPM1-11377C/G多態性及血清脂聯素水平與T2DM存在一定的相關性。本研究通過標準質粒的獲得、ARMS-TaqMan PCR檢測 aPM1-11377C/G多態性方法的建立,對臨床檢測aPM1-11377C/G多態性,預測T2DM提供了初步的科學依據。本研究與國內外大量研究皆表明脂聯素在肥胖、T2DM、心血管疾病患者血中水平下降,脂聯素是脂肪細胞因子中唯一一個在病理狀態下濃度降低的因子,提示我們今后可能通過補充脂聯素來作為治療T2DM的方法之一,因此本研究對于T2DM患者今后的用藥提供了初步的科學依據。

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