155例漢族結核病患者N-乙酰基轉移酶2(NAT2)基因多態性分析

李昕潔 王云南 鄒永紅 何剛 尹小毛 張言斌 蘇雯婕 劉志輝

(1.廣州市胸科醫院 廣州 510095;2.廣州醫學院 廣州 510180)

155例漢族結核病患者N-乙酰基轉移酶2(NAT2)基因多態性分析

李昕潔1王云南1鄒永紅1何剛1尹小毛1張言斌1蘇雯婕2劉志輝1

(1.廣州市胸科醫院 廣州 510095;2.廣州醫學院 廣州 510180)

目的探討中國漢族結核病患者N-乙酰基轉移酶2(NAT2)基因分布特征>。方法應用PCR-DNA測序技術測定外周血淋巴細胞基因組NAT2基因的特定序列,分析常見位點的單核苷酸突變,并與文獻報道的中國其他地區健康人群NAT2基因多態性進行比較>。結果對155例漢族結核病患者NAT2基因的特定序列進行了測定,NAT2等位基因頻率分別為：NAT2*4(50.7%),NAT2*5A(0.6%),NAT2*5B(4.8%),NAT2*5C(1.0%),NAT2*6(28.7%),NAT2*7(14.2%);共檢測到 NAT2*4/4、NAT2*4/5A 、NAT2*4/5B、NAT2*4/5C、NAT2*4/6、NAT2*4/7、NAT2*5B/6、NAT2*5B/7、NAT2*6/6 、NAT2*6/7、NAT2*7/7 11 種基因型 ,根據基因表型的代謝速度將其分為快型(NAT2*4/4)、中間型(NAT2*4/5A、NAT2*4/5B、NAT2*4/5C 、NAT2*4/6、NAT2*4/7)、慢型(NAT2*5B/6、NAT2*5B/7 、NAT2*6/6 、NAT2*6/7 、NAT2*7/7)3類,出現頻率分別為：23.2%,54.9%(1.3%,3.2%,1.9%,34.9%,13.6%),21.9%(1.9%,4.5%,5.8%,9.0%,0.6%);結核病患者與健康人群間的代謝速度分型頻率差異有統計學意義(χ2=11.93,P＜0.01)>。結論中國漢族結核病患者NAT2的基因表型以中間型為主要存在形式(占54.9%),NAT2的基因型分布可能與結核病易感性有關。

結核/酶學;芳基胺N-2酰轉移酶;多肽現象,遺傳;漢族

N-乙酰基轉移酶2(NAT2)是體內重要的Ⅱ相代謝酶,直接影響芳香胺及雜環胺類物質在人體內的代謝,研究表明NAT2的基因多態性與某些疾病的遺傳易感性相關且存在明顯的種族和地域差異。國外已有研究報道南非、俄羅斯等人群中NAT2基因多態性分布與結核病的遺傳易感性之間的關系[1-2],然而在我國,對于NAT2基因多態性在結核病患者中的分布規律則未見報道。本研究應用PCR-DNA測序技術對我國結核病患者外周血淋巴細胞基因組NAT2基因的特定序列進行測定,分析常見位點的單核苷酸突變,旨在了解我國結核病患者NAT2基因多態性分布特征,并為進一步研究NAT2基因多態性與結核病易感性、抗結核藥物肝損害的關系等提供資料。

1 材料和方法

1.1 研究對象 本院確診的漢族結核病患者外周血標本155例,其中男性99例,女性56例,年齡17～81歲,平均42.7歲,個體間無親緣關系。

1.2 儀器與試劑 DNA提取液購自深圳匹基生物工程有限公司;PCR試劑購自美國Promega公司,引物由大連寶生物工程有限公司合成;PCR產物純化試劑購自天根生化科技有限公司;PCR擴增儀為美國Applied Biosystems公司9600 GeneAmp PCR System;DNA測序儀為美國 ABI 3100基因分析儀。

1.3 NAT2基因型檢測

1.3.1 DNA提取 采用密度梯度離心法分離外周血淋巴細胞后,加入40 μ l DNA提取液,漩渦振蕩30 s,于1 680 g離心5 s后100℃水浴10 min;之后以7 280 g離心10 min,吸取上清液置于一新EP管中,-20℃保存備用。

1.3.2 引物設計 根據文獻報道的人類NAT2基因序列設計擴增引物,PCR上、下游引物分別為5′-GCTGGGTCTGGAAGCTCCTC-3′和 5′-TTGGGTGATACATACACAAGGGG-3′。

1.3.3 PCR擴增 (1)反應體系：50 μ l反應體系中,4種dNTP的終濃度均為0.2 mmol/L,上下游引物終濃度均為0.8 mmol/L,TaqDNA聚合酶為1.25 U,模板量為50～100 ng。(2)反應條件：95℃預變性3 min,95℃30 s、60℃30 s、72℃1 min共30個循環,72℃延伸5 min。

1.3.4 PCR產物測序及結果分析 PCR產物進行電泳確定其為NAT2后,陽性標本純化后進行測序分析。(1)測序體系配制：在PCR反應管中依次加入 1 μ l Ready Reaction Premix 、3.5 μ l BigDye Sequencing Buffer、13 μ l去離子水 、0.2 μ l上游引物(濃度為 20 μ mol/L)、0.2 μ l 下游引物(濃度為20 μ mol/L)和 2.5 μ l DNA 模板并混勻。(2)測序反應條件：96℃預變性3 min,96℃10 s、50℃5 s、60℃4 min共25個循環,4℃保存。(3)產物純化后上測序儀檢測,判斷測定序列包含的等位基因類型,并判斷個體基因型。

2 結果

2.1 我國漢族結核病患者NAT2等位基因頻率NAT2*4(50.7%),NAT2*5A(0.6%),NAT2*5B(4.8%),NAT2*5C(1.0%),NAT2*6(28.7%),NAT2*7(14.2%),未檢測到NAT2*14型基因突變。(見表1)

表1 我國漢族結核病患者NAT2等位基因分布頻度

表2 我國漢族結核病患者NAT2基因型分布

表3 結核病患者與健康人群NAT2基因型分布情況

2.2 NAT2基因代謝速度分型 本次實驗共檢測到 NAT2*4/4、NAT2*4/5A、NAT2*4/5B、NAT2*4/5C 、NAT2*4/6 、NAT2*4/7 、NAT2*5B/6、NAT2*5B/7、NAT2*6/6、NAT2*6/7、NAT2*7/7 11種基因型,根據基因表型的代謝速度將其分為快型(NAT 2*4/4)、中間型(NAT 2*4/5A 、NAT2*4/5B 、NAT2*4/5C 、NAT2*4/6、NAT2*4/7)、慢型(NAT2*5B/6、NAT2*5B/7、NAT2*6/6 、NAT2*6/7、NAT2*7/7)3 類 ,分別為23.2%、54.9%、21.9%,以中間型為主,而其中又以NAT2*6等位基因出現頻率最高,頻率分布見表2。

2.3 結核病患者與健康人群NAT2基因型分布情況比較 和文獻[3-4]比較,我國漢族結核病患者與健康人群間的代謝速度分型頻率差異有統計學意義(χ2=11.93,P ＜0.01)(表3)。由此說明：我國漢族結核病患者與健康人群具有不同的NAT2基因型特征。

3 討論

人類N-乙酰基轉移酶(NATs)在體內催化多種藥物和致癌物質的代謝,廣泛分布于胃、小腸、結腸和肝臟,因編碼基因不同而將其分為 NAT1和NAT2 2個亞類。其中NAT2的基因多態性與某些藥物的臨床療效和不良反應的個體差異以及一些疾病的遺傳易感性相關[5],研究不同人群或個體的NAT2多態性具有非常重要的意義。

NAT2基因位于人類第8對染色體的短臂2區2帶(8p22)上,目前已發現有26種等位基因[6],常見的等位基因突變主要發生在191、282、341、481、590、803、857 7 個位點,其中亞洲人以 481(M1)、590(M2)、857(M3)和191(M4)等位點的基因突變為常見。多態性的NAT2等位基因構成了多態性的NAT2基因型,根據乙酰化代謝能力的不同,NAT2基因表型可分為：快速乙酰化型、中間型、慢乙酰化型。快乙酰化型是野生純合子型(NAT2*4/4),中間型是野生型和突變型的雜合子型(NAT 2*4/5,NAT2*4/6,NAT2*4/7),而慢乙酰化型是指純合突變型(含有NAT2*5,NAT2*6,NAT2*7任意2或3個等位基因)。

NAT2基因的多態性具有顯著的種族和地區差異,其等位基因突變的發生導致酶活性下降、穩定性降低及表達量減少使得乙酰化代謝能力受損,造成個體對疾病易感性的差異。國外已有報道研究NAT2基因多態性分布與結核病的遺傳易感性之間的關系[1-2]：在俄羅斯本土人群中,NAT2的基因多態性與結核病易感性相關,以NAT2*5/5基因型在結核病人中的出現頻率顯著高于健康對照人群;Adams等[2]研究則顯示,南非人群中NAT2快型基因型占有很高比例,可能與南非人群結核病易感性有關。本次研究對155例結核病患者的外周血淋巴細胞NAT2基因多態性進行檢測,共檢測到NAT2*4/4 、NAT 2*4/5A 、NAT 2*4/5B 、NAT 2*4/5C 、NAT2*4/6、NAT2*4/7 、NAT2*5B/6、NAT2*5B/7 、NAT2*6/6 、NAT2*6/7 、NAT2*7/7共11種基因型,各基因型頻率分別為：23.2%、1.3%、3.2%、1.9%、34.8%、13.6%、1.9%、4.5%、5.8%、9.0%、0.6%。其中,中間型(NAT2*4/5A 、NAT2*4/5B 、NAT2*4/5C 、NAT2*4/6、NAT2*4/7)所占比例最大,為54.9%;快速乙酰化型、慢速乙酰化型分別為23.2%,21.9%,說明我國結核病患者NAT2基因表型以中間型最為常見。NAT2各等位基因分布頻率為：NAT2*4(50.7%),NAT2*5A(0.6%),NAT2*5B(4.8%),NAT2*5C(1.0%),NAT2*6(28.7%),NAT2*7(14.2%),以NAT2*4出現頻率最高,其次為 NAT2*6和 NAT2*7、NAT2*5A 、NAT2*5B、NAT2*5C則出現較少,未檢測到NAT2*14型基因突變,我們也注意到在慢速乙酰化型基因表型中,NAT2*6等位基因出現頻率最高。同時我們也將結核病患者NAT2基因型分布頻率與文獻報道[3-4]我國其他地區健康人群NAT2基因型分布頻率做比較,2者之間差異有統計學意義(χ2=11.93,P＜0.01),提示我們NAT2基因型分布可能與我國漢族人群結核病易感性相關。在我們的研究中,中間型出現頻率最高,且顯著高于健康人群,這與國外的一些報道結果不盡相同[1],這可能是由于所在的地域不同,研究人群有所差別所致。

另外,也有文獻報道其慢乙酰化型與抗結核藥物治療的肝功能損害發生關聯[7]。

綜上所述,本研究為我國漢族結核病患者NAT2基因多態性分布特點提供了可靠數據,對研究NAT2基因多態性與抗結核藥物肝損害的關系提供了一定的參考價值。同時,本研究結果初步提示NAT2基因多態性與結核病易感性相關,但對其作用機制還不了解,需擴大樣本量做進一步的研究。

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[3]高建平,黃躍東,梁建平,蔡秀珍.福建地區漢族人群 N-乙酰基轉移酶基因多態性[J].中國現代醫學雜志,2003,13(21)：32-34.

[4]鄧剛,張雄信,包其郁.溫州地區漢族人群N-乙酰基轉移酶2基因多態性分析[J].中國優生與遺傳雜志,2006,14(12)：35-36.

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An analysis on N-acetytransferase 2 genetic polymorphisms in 155 Hans Chinese patients with tuberculosis

Li Xinjie1,Wang Y unnan1,Zou Y onghong1,He Gang1,Y in Xiaomao1,Zhang Y anbin1,Su Wenjie2,Liu Zhihui1
(1.Guangzhou Chest Hospital,Guangzhou510095,China;2.Guangzhou Medical College,Guangzhou510180,China)

ObjectiveTo determine the distribution of N-acetyltransferase 2(NAT2)genetic polymorphisms in Chinese Hans TB patients.MethodsT he specific gene sequence of NAT2 from peripheral blood lymphocytes were detected by PCR-DNA sequencing technique and the common sites of single nucleotide polymorphism were analysed.These results were compared with the data of healthy population reported in other articles.ResultsOf 155 Chinese Hans TB patients,the alleles genetic frequencies of NAT2*4,NAT2*5A,NAT2*5B,NAT2*5C,NAT2*6,and NAT2*7 were 50.7%,0.6%,4.8%,1.0%,28.7%and 14.2%respectively.11 genotypes as follow were detected：NAT2*4/4,NAT2*4/5A,NAT2*4/5B,NAT2*4/5C,NAT2*4/6,NAT2*4/7,NAT2*5B/6,NAT2*5B/7,NAT2*6/6,NAT2*6/7 and NAT2*7/7.According to the metabolic phenotype,these genotypes were divided into fast type(NAT2*4/4),interme-diate type(NAT2*4/5A,NAT2*4/5B,NAT2*4/5C,NAT2*4/6,NAT2*4/7)and slow type(NAT2*5B/6,NAT2*5B/7,NAT2*6/6,NAT2*6/7,NAT2*7/7).And their frequencies were 23.2%,54.9%(1.3%,3.2%,1.9%,34.9%,13.6%),and 21.9%(1.9%,4.5%,5.8%,9.0%,0.6%),respectively.There are significant difference in the phenotype distribution between TB patients and healthy population(χ2=11.93,P ＜0.01).ConclusionsThe intermediate type of NAT2 genotype in Chinese Hans TB patients was main form,and NAT2 genotype distribution may be associated with TB susceptibility.

tuberculosis/enzymology;arylamire N-acetyltransferase;polymorphism,genetic;Han nationality

Wang Yunnan(13059192298@wo.com.cn)

王云南(13059192298@wo.com.cn)

廣東省科技計劃項目(2008B030301265)

2011-03-25)

(本文編輯：范永德)