外周組織損傷對脊髓AMPA受體突觸表達的影響及其機制

劉燕妮，索占偉，楊 嫻，時 蕾，曹 靜，李 帥，許英明，楊鴻斌，胡曉東

(蘭州大學藥學院分子藥理研究所，甘肅蘭州 730000)

AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid)型谷氨酸受體介導神經系統中絕大部分的快反應興奮性突觸傳遞。在脊髓背角，生理性痛刺激通過初級傳入纖維，向脊髓釋放谷氨酸，激活突觸后AMPA受體，促進痛覺信息向更高級的中樞傳遞。而當外周組織或神經損傷之后，脊髓AMPA受體的功能會明顯升高，AMPA受體介導的興奮性突觸傳遞發生持久性的可塑性變化，最終導致慢性病理性疼痛的形成。

資料顯示:AMPA受體的功能異常，與AMPA受體在突觸中的表達數目、以及AMPA受體的亞基構成(subunit composition)密切相關［1］。在成年動物，脊髓背角AMPA受體主要是由GluR1、GluR2、GluR3亞基組合形成的四聚體，其中最常見的受體由2個GluR2和2個 GluR1、或者是2個 GluR2和2個GluR3所組成。GluR2作為構成AMPA受體的關鍵組分，不僅能夠通過細胞內的突觸輸送(synaptic trafficking)過程，調節AMPA受體的突觸含量，而且決定著AMPA受體的一系列生理生化特征，如AMPA受體的鈣通透性、內向整流特性等。已有研究提示:GluR2可能參與慢性炎性疼痛過程［2］。但外周組織損傷是否直接調節脊髓GluR2的突觸表達而促進中樞敏感化的形成，至今尚不清楚。

為探討AMPA受體在突觸中的表達變化與炎性疼痛形成的關系，本研究建立完全弗氏佐劑(CFA)炎性疼痛模型，觀察GluR2亞基在脊髓突觸中的變化，并分析慢性炎性疼痛中的一個關鍵激酶——cAMP 依賴性蛋白激酶(PKA)［3］在此過程中的可能作用。

1 材料與方法

1.1動物昆明種成年小鼠(♂，20～22g)，由蘭州大學實驗動物中心提供。

1.2試劑完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA;Sigma);PKA抑制劑H-89(Sigma);鼠抗GluR2抗體(Millipore Corporation，Temecula，CA，USA)，鼠抗β-actin抗體(江蘇碧云天);辣根過氧化物(HRP)標記二抗(Jackson Immunoresearch Laboratories，Baltimore，PA，USA);ECL發光試劑盒(江蘇碧云天)。

1.3疼痛模型制備［4］小鼠經乙醚淺麻醉后，后足底二、三趾之間的皮下推入CFA 25 μl，對照組在相同部位注射等容量的生理鹽水。造模前、后進行行為學測試。

1.4行為學測試及鞘內給藥［5］采用Up-Down法測定 Von Frey纖維 (Stoelting，Wood Dale，IL，USA)誘發的縮足閾值(PWT)。鞘內給藥采用經皮直接注射法，動物經乙醚淺麻醉后，用25 μl的微量進樣器于L5-L6棘突間隙經皮穿刺，以進針產生空洞感并伴隨動物甩尾，作為針頭進入蛛網膜下腔的標志，緩慢注射藥物5 μl，對照組注射同等體積的生理鹽水。

1.5亞細胞結構分離根據我們前期報道的方法［5］，動物經苯巴比妥鈉 (30 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，行錐板切開術，分離L4-L5節段脊髓。在4℃細胞裂解緩沖液中制備勻漿。勻漿液經1 000×g離心10 min，取上清(S1);S1經10 000×g離心15 min，收集富含突觸小體 (synaptosome)的沉淀P2;P2用含0.5%Triton X-100的細胞緩沖液裂解15 min后，32 000×g離心20 min，得到富含突觸后致密質(PSD)的沉淀P3。以上操作均在4℃下進行。P3經重新懸浮后，加入4×樣品緩沖液，煮沸5 min，進行Western blot檢測。

1.6免疫印跡用8%SDS-PAGE電泳分離蛋白;轉移到PVDF膜上;經5%脫脂奶粉室溫封閉30 min后，以相應蛋白的抗體4℃孵育過夜;印跡膜經洗滌后，用HRP標記的二抗室溫孵育1 h，以ECL發光試劑盒顯像;以Image J軟件進行圖像分析。

1.7數據統計數據均以±s表示;采用One-way ANOVA、post-hoc Tukey HSD進行顯著性檢驗。

2 結果

2.1CFA對小鼠縮足閾值的影響及其與PKA的關系行為學結果顯示:注射CFA后24 h，小鼠的縮足閾值低于生理鹽水對照組，提示機械性痛覺超敏的形成;此時，鞘內注射PKA抑制劑H-89，則明顯提高炎性疼痛小鼠的縮足閾值，且其作用至少持續30 min(Fig 1)，提示PKA在炎性疼痛中的重要作用。

Fig 1 Effect of CFA on PWT of mice and its relation with PKA

2.2CFA對脊髓背角AMPA受體GluR2亞基突觸表達的影響及其與PKA的關系為探討AMPA受體在痛覺超敏中的作用，本試驗在注射CFA后24 h，分離脊髓背角，提取富含PSD的亞細胞結構，檢測AMPA受體GluR2亞基的突觸表達，發現炎性疼痛組動物的GluR2突觸含量升高，與生理鹽水對照組相比，差異有顯著性(Fig 2)。而在注射CFA后24 h，鞘內給予PKA抑制劑H-89處理脊髓30 min，發現H-89能降低GluR2的突觸含量(Fig 2)，和CFA組動物相比較，差異有顯著性。與炎性疼痛動物不同，正常小鼠鞘內注射H-89后30 min，動物的縮足閾值無變化(salinevsH-89:1.82±0.24 gvs1.72±0.15 g，P＞0.05，n=4);隨后的免疫印跡實驗也顯示:H-89對正常小鼠GluR2的突觸含量無影響(Fig 3)。這些實驗結果提示:外周組織損傷，可能通過激活脊髓背角PKA，提高AMPA受體GluR2亞基的突觸表達，從而參與痛覺超敏的形成。

Fig 2 Effect of CFA on synaptic content of GluR2 subunits and its relation with PKA.

3 討論

AMPA受體介導痛覺信息從外周向中樞的傳遞，并在病理性疼痛的形成中發揮重要作用。抑制AMPA受體的活性，能夠明顯緩解外周組織或神經損傷誘發的痛覺超敏，而直接激動脊髓AMPA受體甚至在正常動物中也能誘發痛覺異常［6］。近年來大量的研究證實:突觸后膜上AMPA受體的數目高度可變，這種動態變化是突觸傳遞效率發生長時程改變的重要機制，并在學習、記憶以及許多神經系統疾病中扮演關鍵角色。然而，對于AMPA受體在慢性炎性疼痛中的突觸表達變化，至目前為止尚存在很大爭議。曾經有實驗通過間接地檢測胞質內AMPA受體的含量［2］，發現外周組織損傷可能調節脊髓背角GluR2亞基的內陷過程，影響AMPA受體的突觸表達。而本實驗直接提取富含突觸后致密質(PSD)的亞細胞結構，測定炎性疼痛過程中GluR2的突觸含量，發現CFA在誘發痛覺超敏的同時，能夠明顯提高脊髓GluR2的突觸數目，說明痛覺超敏的形成與GluR2的突觸聚集密切相關。GluR2亞基的突觸表達增多，可能易化AMPA受體介導的痛覺信息的突觸傳遞，從而導致慢性疼痛的形成。

Fig 3 Intrathecal application of PKA inhibitor H-89(2.5 μg)for 30 min generated minimal effects on the synaptic contents of GluR2 subunits in spinal dorsal horn of intact mice.

大量的實驗顯示:AMPA受體的突觸輸送過程，受到PKA、PKC(蛋白激酶C)等絲氨酸/蘇氨酸激酶、以及蛋白酪氨酸激酶(PTKs)的調控。在AMPA受體的GluR1亞基中，包含有PKC和PKA的磷酸化位點(分別為第831位絲氨酸和第845位絲氨酸)，PKC/PKA對GluR1的催化磷酸化，能夠提高GluR1在細胞膜表面及突觸中的表達，增強興奮性谷氨酸能突觸傳遞［7-8］。而在GluR2亞基的胞質C-末端，則包含有多個酪氨酸的磷酸化位點;Src家族酪氨酸激酶(SFKs)對GluR2的磷酸化，能夠調節GluR2與PDZ蛋白(如PICK1、GRIP1/2等)的結合，影響GluR2的內陷過程，從而調節GluR2的突觸表達水平［9］。本文研究結果顯示:抑制PKA的活性，能夠明顯拮抗組織損傷誘發的GluR2亞基的突觸異常表達，且這一過程與炎性疼痛的緩解密切相關，提示脊髓PKA可能是促進GluR2向突觸聚集的關鍵分子。而且我們的前期研究也顯示:PKA能夠激活脊髓背角Src家族酪氨酸激酶成員Fyn，參與脊髓背角痛覺信息的整合與調制［10］。因此，我們推測:PKA對GluR2突觸表達的調節，可能與Src家族酪氨酸激酶有關。但其具體的機制尚有待于進一步的深入研究。

［1］Newpher T M，Ehlers M D.Glutamate receptor dynamics in dendritic microdomains［J］.Neuron，2008，58(4):472-97.

［2］Park J S，Voitenko N，Petralia R S，et al.Persistent inflammation induces GluR2 internalization via NMDA receptor-triggered PKC activation in dorsal horn neurons［J］.J Neurosci，2009，29(10):3206-19.

［3］Malmberg A B，Brandon E P，Idzerda R L，et al.Diminished inflammation and nociceptive pain with preservation of neuropathic pain in mice with a targeted mutation of the type I regulatory subunit of cAMP-dependent protein kinase［J］.J Neurosci，1997，17(19):7462-70.

［4］楊鴻斌，楊 嫻，曹 靜，等.SHP2抑制劑NSC-87877對炎性疼痛的抑制作用及其機制［J］.中國藥理學通報，2010，21(5):981-4.

［4］Yang H B，Yang X，Cao J，et al.Inhibitory effects of SHP2 blocker NSC-87877 on inflammatory pain and its underlying mechanisms［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(9):1142-5.

［5］索占偉，楊 嫻，曹 靜，等.脊髓背角PKC在慢性炎性疼痛中的作用及其機制［J］.中國藥理學通報，2011，27(3):421-4.

［5］Suo Z W，Yang X，Cao J，et al.Involvement of spinal PKC in inflammatory pain and its underlying mechanisms［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27(3):421-4.

［6］Minami T，Matsumura S，Okuda A E，et al.Characterization of the glutamatergic system for induction and maintenance of allodynia［J］.Brain Res，2001，895(1-2):178-85.

［7］Fang L，Wu J，Zhang X，et al.Increased phosphorylation of the GluR1 subunit of spinal cord alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate receptor in rats following intradermal injection of capsaicin［J］.Neuroscience，2003，122(1):237-45.

［8］Lu Y，Sun Y N，Wu X，et al.Role of alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionate(AMPA)receptor subunit GluR1 in spinal dorsal horn in inflammatory nociception and neuropathic nociception in rat［J］.Brain Res，2008，1200:19-26.

［9］Zhang Y，Venkitaramani D V，Gladding C M，et al.The tyrosine phosphatase STEP mediates AMPA receptor endocytosis after metabotropic glutamate receptor stimulation ［J］.J Neurosci，2008，28(42):10561-6.

［10］Yang H B，Yang X，Cao J，et al.cAMP-dependent protein kinase activated Fyn in spinal dorsal horn to regulate NMDA receptor function during inflammatory pain［J］.J Neurochem，2011，116(1):93-104.