桑葉提取物的抑菌活性及其揮發性組分的氣相色譜 -質譜分析

劉志明 王海英 張 爽

(1東北林業大學材料科學與工程學院,生物質材料科學與技術教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150040;2東北林業大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040)

桑葉提取物的抑菌活性及其揮發性組分的氣相色譜 -質譜分析

劉志明1王海英2張 爽2

(1東北林業大學材料科學與工程學院,生物質材料科學與技術教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150040;2東北林業大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040)

通過對桑葉正己烷提取物、桑葉二氯甲烷提取物進行抑菌活性試驗和對桑葉正己烷提取物中揮發性組分進行氣相色譜 -質譜分析結果表明:桑葉正己烷提取物、桑葉二氯甲烷提取物對金黃色葡萄球菌均有抑制作用,桑葉正己烷提取物的抑菌圈直徑為7.11mm,桑葉二氯甲烷提取物的抑菌圈直徑為7.09mm,而桑葉正己烷提取物與桑葉二氯甲烷提取物對大腸桿菌均無抑制作用。氣相色譜 -質譜檢測分析桑葉正己烷提取物的主要揮發性組分及其質量分數為十八烷(39.48%)、環二十八烷(8.79%)、棕櫚酸 (7.19%)、二十九烷 (6.61%)、鄰苯二甲酸二丁酯 (6.22%)、亞麻醇 (6.01%)、丁香酚(0.40%),其中的亞麻醇和丁香酚是具有抑菌潛力的化合物。

桑葉提取物;正己烷;二氯甲烷;抑菌活性;揮發性組分;氣相色譜-質譜法

桑葉是?？?Moraceae)植物桑(Morus alba L.)的葉片,又名“鐵扇子”或“蠶葉”,是傳統中草藥之一［1-3］。桑葉中含有黃酮類、生物堿類、多糖類、植物甾醇類、揮發油類、氨基酸、維生素等化合物,具有降血糖、降血脂、抗菌等功效［4-6］。李有貴等［7］研究了 59份野生桑桑葉中的 1-脫氧野尻霉素含量及粗提物對 α-糖苷酶的抑制活性,多羥基生物堿 1-脫氧野尻霉素是桑葉提取物中具有降血糖作用的主要活性成分之一。仝義超［8］進行了桑葉降血糖、降血脂研究及其產品開發。郭小補等［9］進行了不同桑品種的桑葉總黃酮含量與體外抗氧化活性的相關性研究。桑葉除了作為中草藥應用于醫藥領域,還可應用于食品等領域［3,10-12］。楊清等［13］進行了桑紅茶發酵工藝條件優化及活性成分含量的動力學研究,楊普香等［14］研究了桑葉含片的加工。桑葉高附加值產品的開發利用已成為桑葉產品開發的熱點之一。研究表明鮮桑葉水浸出液［15］、干桑葉乙醇提浸膏［16］、新鮮桑葉汁［17］以及質量濃度為 0.1 g/m L的干桑葉水提取物［18］對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等均有抑制作用。

桑葉提取物的抑菌活性因桑葉的生長環境、桑葉活性物質的提取方式不同而有差異。植物在生長過程中通過次生代謝產生的揮發性物質具有防御害蟲、抑菌等作用,從而保護自身不受病蟲害侵害［19-23］,將植物中的揮發性有效成分提取出來進行產品開發是當今回歸自然、環境友好產品開發的研究重點之一。本研究對利用正己烷和二氯甲烷浸提桑葉獲得的提取物進行抑菌活性比較,并采用氣相色譜 -質譜(GC-MS)法分析提取物的揮發性組分,探討桑葉提取物的有效活性組分,為桑葉的高附加值產品開發提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試桑葉:龍桑一號的 3年嫁接苗的新鮮葉片,2009年 8月下旬采摘于黑龍江省齊齊哈爾市甘南林場桑產業科技示范園。

供試菌株:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli),均購自黑龍江省科學院應用微生物研究所。在無菌條件下用劃線法將供試菌株移接入斜面培養基上,在 37℃培養箱中培養 24 h。取出活化好的菌株,用適量無菌 9 g/L氯化鈉溶液,將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別配置成濃度為 9×106、5×106cfu/mL的菌懸液備用。

主要藥品與儀器:正己烷、二氯甲烷均為分析純,均購自天津市科密歐化學試劑開發中心;超凈工作臺,上海博訊實業有限公司醫療設備廠生產;SPX-80B生化培養箱,DSX-180A手提式高壓蒸汽滅菌鍋,均為上海躍進醫療器械廠生產;GC-MS 6890N-5973 insert氣相色譜 -質譜聯用儀,美國 Agilent公司生產。培養基:蛋白胨 10 g,氯化鈉 10 g,酵母提取物 5 g,瓊脂 20 g,去離子水 1 000 mL,用1 mol/L氫氧化鈉溶液調節 pH 7.0～7.5。

1.2 試驗方法

1.2.1 桑葉正己烷與二氯甲烷提取物的制備 各取 15 g鮮桑葉(整片)放入 2個 500mL索氏提取器中,分別加入 300mL正己烷、二氯甲烷,在恒溫水浴85℃下連續回流提取 24 h,提取液經旋轉薄膜蒸發器蒸去溶劑,得到桑葉正己烷或二氯甲烷提取物浸膏;分別將提取物浸膏用二氯甲烷溶解,配制成質量濃度為 0.1 g/m L的溶液備用。

1.2.2 桑葉正己烷與二氯甲烷提取物的抑菌活性試驗 采用濾紙片法［16］和平板菌落計數法［18］進行抑菌試驗。將移液器、鑷子、培養基、9 g/L NaCl溶液、試管及三角瓶等用牛皮紙包好,濾紙用打孔器打成 6mm的紙片,裝于潔凈三角瓶中,置于高壓滅菌鍋內,121℃下濕熱滅菌 20min,備用。用移液器吸取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌懸液 0.05 m L于無菌平皿中,然后倒入已冷卻至 45℃的培養基15m L,充分混勻后水平放置,制成含菌平板。用鑷子將濾紙片放入桑葉正己烷提取物、桑葉二氯甲烷提取物溶液中,浸泡 10min后取出,待溶劑揮發后,將紙片貼在含菌平板上,每個平板貼 3片濾紙,每個紙片相隔一定間距,并用浸有二氯甲烷的濾紙片作對照,貼上標簽。每個處理 3個重復。放入培養箱37℃下培養24 h,測定抑菌圈直徑,取其平均值。以上操作均在超凈工作臺上完成。

1.2.3 桑葉正己烷提取物的氣相色譜 -質譜分析(GC-MS) 用甲醇(色譜純)將桑葉正己烷提取物(經旋轉薄膜蒸發器蒸去正己烷獲得的提取物)配制成質量濃度為 0.04 g/m L的溶液,利用 GC-MS 6890N-5973insert氣相色譜 -質譜聯用儀,對0.04 g/mL提取物甲醇溶液進行氣質聯用分析。氣相色譜分析條件:DB-17MS毛細管柱(30 m×0.25mm×0.25μm),FID檢測器;初始溫度 40℃,保持 4min后以20℃/m in升溫至150℃,接著再以5℃/m in升溫至 240℃,保持 5 min;進樣口溫度260℃,進樣量 1.0μL,不分流,載氣氦氣,流速1m L/min。質譜條件:連接口溫度 280℃,離子源溫度 230℃,轟擊電壓 70 eV,掃描檢測范圍 15～260 u。

2 結果與分析

2.1 桑葉正己烷與二氯甲烷提取物的抑菌活性比較

從桑葉正己烷與二氯甲烷提取物對供試菌種的抑制效果看(表 1),桑葉正己烷與桑葉二氯甲烷提取物均對金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用,抑菌圈直徑分別為 7.11、7.09mm;從表 1中還可看出桑葉正己烷提取物與桑葉二氯甲烷提取物對大腸桿菌均無抑制作用。

表 1 桑葉正己烷與二氯甲烷提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果

2.2 桑葉正己烷提取物的氣相色譜 -質譜分析

由于抑菌試驗中常需要檢測金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果,且正己烷是常用的提取植物天然產物較好的溶劑之一,加上桑葉正己烷提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑較大;因此,下面只對桑葉正己烷提取物進行氣相色譜 -質譜分析。

經計算機 NIST質譜庫自動檢索、解析和部分化合物的人工解析,鑒定出桑葉正己烷提取物中有 13種揮發性成分,通過面積歸一化法計算各組分的質量分數(表 2)。從表 2可以看出,桑葉正己烷提取物中主要揮發性組分為十八烷(39.48%)、環二十八烷 (8.79%)、棕櫚 酸 (7.19%)、二十九 烷(6.61%)、鄰苯二甲酸二丁酯(6.22%)、亞麻醇(6.01%)、鄰苯二甲酸二異丁酯(4.38%);此外,桑葉正己烷提取物中還含有丁香酚、植醇、亞麻酸甲酯等揮發性組分。

表 2 桑葉正己烷提取物揮發性組分的氣相色譜-質譜分析

3 小結與討論

桑葉的傳統應用主要是作為藥用(中草藥)和飼用(養蠶飼料),將桑葉中的有效成分提取出來,應用于食品等產品開發,是提高桑葉經濟附加值的手段之一。用植物天然產物的常用提取劑正己烷和二氯甲烷分別浸提桑葉,獲得的桑葉提取物進行抑菌活性試驗,結果表明:桑葉正己烷的提取物與桑葉二氯甲烷的提取物,對金黃色葡萄球菌均有抑制作用,但對大腸桿菌均無抑制作用。對桑葉正己烷提取物進行氣相色譜 -質譜分析的結果表明,其提取物中含有亞麻醇、丁香酚等具有抑菌作用的揮發性組分。有研究表明,亞麻醇可以作為抗菌劑預防齲齒和牙周病［24］,丁香酚也具有抑菌作用［25］。關于桑葉正己烷提取物的抑菌活性物質的分離、鑒定及其抑菌機制有待于進一步研究。

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S888.2

A

1007-0982(2011)02-0026-03

2010-12-20;

2011-01-19

黑龍江省林業廳科技推廣項目(編號 01043208003)。

劉志明(1971—),男,黑龍江,博士,副教授。

Tel:0451-82191740,E-mail:zhimingliuwhy@126.com