馬鈴薯種質的健康檢驗及其無毒苗的再生

穆艷娥，王拴福，姬青云，柴生武，鄧利愛，張東紅，石維山

（山西省薯類脫毒中心，山西太原 030006）

馬鈴薯種質有廣泛的應用，健康種質是馬鈴薯生產和品質改良的基本要求。我國動植物檢疫法則明確規定，由于馬鈴薯帶有多種危險性病毒及其他有害生物，禁止進口種用馬鈴薯塊莖及其他繁殖材料。國內生產的馬鈴薯原種也必須維持較高的健康水平，否則，通過良種繁育體系生產的馬鈴薯種薯就可能先天帶毒，從而引起重大的產量損失。健康種質是指不帶有任何有害生物和危險性病毒，如細菌、真菌、病菌、類菌原體、線蟲、昆蟲等。因為許多病毒在馬鈴薯種質交換過程中可以通過種、苗和花粉傳播，這些病毒極可能隨之擴散蔓延。近年來，隨著科學技術的發展，病毒檢測技術得到了很快的發展應用，除了傳統的生物學測定外，電鏡、血清學檢測、核酸探針及PCR技術等都被用于病毒檢測，大大提高了病毒檢測的靈敏度和準確率。與此同時，病毒治療技術除了莖尖脫毒、熱處理治療外，化學治療也有了新的發展。為了提高馬鈴薯遺傳種質的健康水平，我們對3個用作遺傳種質的馬鈴薯進行了病毒檢測研究，發現3個品種均帶PVX及PVY病毒，最后經莖尖培養獲得了這3個品種的健康無毒苗。

1 材料與方法

1.1 材料來源

材料來自山東樂陵希森馬鈴薯產業集團的3個擬進行病毒抗性改良的馬鈴薯保存品種，編號為P1，P2，P3。

1.2 原始材料的健康檢測

將3個品種分別種植，出苗后編號，以株為單位進行抽樣檢測。根據馬鈴薯可能攜帶的病毒，生物測定選用昆諾阿藜、千日紅、普通煙、蔓陀蘿等指示植物作為鑒別寄主，通過汁液摩擦接種，在溫室中觀察15天以上；酶聯檢測采用SPA-ELISA，以馬鈴薯X及Y病毒的抗血清檢測樣品中有無PVX及PVY。

1.3 莖尖組培脫毒

自原始材料取0.5 cm以下的莖尖或其側芽，接種在分化培養基M1、M2及M3上，成苗后轉至生長培養基M0上，切斷的莖尖用M培養基培養。MS基本培養基配方及配制方法如下：

M0： MS pH=5.8；

M1： MS+泛酸鈣 2 mg/L+GA30.25 mg/L，pH=5.8；

M2：MS+BA 0.1 mg/L+泛酸鈣 2 mg/L+GA30.25 mg/L，pH=5.8；

M3： MS+NAA 0.05 mg/L+泛酸鈣 2 mg/L+GA30.05 mg/L，pH=5.8；

M∶ MS+B9 5 mg/L，pH=5.8。

通過分化培養基上的成苗情況，比較3種分化培養基的效果。

1.4 無毒苗的健康檢測

對獲得的各個無性系進行繁殖，到一定的生物量時各稱取5 g，通過指示植物進行生物測定、電鏡觀察及A蛋白酶聯進行針對PVX及PVY病毒的檢測。生物測定及酶聯檢測方法同上，電鏡觀察采用直沾法及免疫電鏡。

2 結果

2.1 原始材料的健康檢測

2.1.1 生物學測定：將3個品種的各個樣品各接種到一套鑒別寄主上，結果在寄主昆諾阿藜上出現壞死斑，心葉煙上出現斑駁，千日紅上出現紅斑，普通煙上出現局部壞死斑、心葉明脈、花葉。由此可見，這3個馬鈴薯品種不同程度地帶毒。

2.1.2 酶聯檢測：以馬鈴薯X及Y病毒抗血清進行的酶聯檢測，結果見表1。表1說明這3個品種帶有馬鈴薯X和Y病毒，但帶毒種類及帶毒率有所不同。其中，以P1帶毒率最高，而PVX在3個品種上均可見。

表1 三個品種的帶毒檢測

2.2 莖尖分化與成苗

2.2.1 莖尖分化：莖尖在各種分化培養基上的表現見表2。從培養效果看，3種分化培養基均可培養成苗，但以M3稍好。

表2 莖尖在不同培養基上的分化情況

2.2.2 切段繁殖：莖尖成苗后,在生長至1 cm時轉接到M0培養基上，有數個莖節時切段轉接到M或M0培養基上。比較M和M0培養基的繁殖效果發現，M培養基上的苗較粗壯，節間短,較適合作壯苗培養繁殖。

2.3 無性系的健康檢測

對經過莖尖脫毒處理的所有分化苗進行病毒檢測,部分無性系的結果如下：

2.3.1 生物測定：結果見表3，表明這幾個無性系在幾種鑒別寄主上無病毒侵染性表現。

表3 莖尖生物學測定

2.3.2 酶聯檢測結果：將樣品材料磨碎進行SPAELISA測定，分別設陽性及陰性對照，以馬鈴薯實生苗為健康（陰性）對照，兩倍于陰性值者為陽性。檢測結果，上述3個無性系均顯陰性（見表4）。

表4 莖尖酶聯檢測表

2.3.3 免疫電鏡觀察：以PVX、PVY及PLRV抗血清吸附進行免疫電鏡觀察，結果在P1-8，P2-2及P3-1無性系未見病毒粒體。

根據以上結果我們判定，上述幾個品系經脫毒處理后已成為無上述病毒的健康無性系。

3 討論與結論

馬鈴薯健康檢驗及無毒苗再生是一項技術要求嚴格、工作量大又十分耗時的工作。本文針對馬鈴薯試管苗進行的健康檢驗 ，主要是對馬鈴薯病毒進行檢測。馬鈴薯病毒很多 ，但以PVX及PVY最為常見，國內也有相關的報道，對原始材料進行的檢驗結果也說明了這一點。通常馬鈴薯卷葉病毒在田間表現一般很明顯，但原始材料試種沒有明顯的卷葉癥狀 ，所以在對脫毒苗進行病毒檢測時就主要針對PVX和PVY進行。最后獲得的是不帶PVX及PVY的馬鈴薯無性系，基本上達到了無毒苗再生的目的，滿足了健康種質的要求。

3.1 病毒檢測的方法

病毒的檢測方法最關鍵的是其靈敏度及其檢測結果的可靠性。PCR、血清學方法、電子顯微鏡等高靈敏度的檢測方法只在具備實驗條件的實驗室且對已知的研究較好的病毒有效。當未知材料中的病毒狀況時，為提高檢測的可靠性，應用不同的檢測方法對病毒的不同特征進行檢測是十分必要的。本文應用了生物學測定、血清學方法及電鏡技術進行病毒侵染性、抗原性及形態特征的檢測，一定程度上提高了檢測的可靠性。

3.2 無毒苗的標準

從理論上講，無毒苗是指無任何病毒 ，但實際操作中，標準卻很難掌握，經過莖尖脫毒處理的苗，一般病毒濃度含量較低，而任何一種檢測方法都有其一定的靈敏度，當試材中的病毒濃度在靈敏度以下時就可能出現誤判。由此可見，無毒苗的標準是相對的，可能因人而異 ，因技術水平而異。為盡量減少這方面的風險，在進行無毒苗的病毒檢測時，需要使馬鈴薯組培苗生長到一定的量，以使病毒濃度達到一定的水平；同時多次進行檢測，以免漏檢。本文中述及多種檢測方法正是出于這種考慮，力求將無毒苗的風險降到最低水平。很多情況下,脫毒苗是相對已知的病毒而言的,本試驗中主要是針對PVX和PVY進行的，如果存在未研究很好的未知病毒，又缺乏行之有效的檢測手段,脫毒苗能否稱為無毒苗就值得考慮。

3.3 無毒苗再生

通常為了提高脫毒的效率，一般用熱處理+化學治療+莖尖培養結合使用培養無毒苗，但本試驗由于條件所限只采用莖尖脫毒，脫毒效率相對較低，另外選材也可能影響脫毒的效果。其次，在試驗中所取的莖尖大多為側芽的生長點，這對試驗的結果有無影響，由于未能做到跟蹤檢測 ，一時還難下結論，但在試材有限的情況下(對于種質資源多數如此)，應用側芽也是一種選擇。

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