正交實驗結合指紋圖譜篩選白鮮皮提取工藝

鄧 翀，顏永剛，姚天鵝

(陜西中醫學院，陜西 咸陽 712046)

白鮮皮為蕓香科植物白鮮 (Dictamnus dascarpus Turczl)的干燥根皮，是一種常見的中草藥，為歷代本草及中國藥典收藏。別名有白鮮，蘚皮，地羊膻，金雀兒椒，八股牛，白羊鮮等。其味咸，苦，性寒，具清熱燥濕，祛風解毒，止癢等功效。臨床用于濕熱瘡毒，黃水淋漓，濕疹，風疹，疥癬瘡癩，風濕熱痹，黃疸尿赤等癥[1]。目前對白鮮皮提取工藝的研究報道主要以總浸膏量和白鮮堿為評價指標進行研究[2－3]。由于總浸膏量為評價指標缺乏準確性以及白鮮堿為評價指標的單一性，本實驗從整體化學成分角度，以HPLC化學指紋圖譜的多成分相對含量為控制指標考察白鮮皮的提取工藝，篩選白鮮皮提取工藝。為白鮮皮提取分離提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高效色譜儀 (L－2130二元泵，L－2400檢測器，日本日立公司)，電子天平 (薩多利斯GB2042電子天平 (瑞典)，0.1mg)，電熱恒溫水浴鍋 (北京市光明醫療儀器廠)。

1.2 材料

白鮮皮采集于陜西省太白山紅河谷 (由陜西中醫學院王繼濤高級實驗師采集并鑒定);白鮮堿對照品 (購自中國藥品生物制品檢定所，批號:111654－200301);色譜乙 (科密歐公司);水為娃哈哈純凈水;其余試劑為分析純。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液制備

精密稱取白鮮皮藥材粉末 (60目篩)約5g，以適當的溶劑為提取溶媒，按照實驗設計的方法進行提取，濾過，提取液在80℃水浴濃縮，揮干溶媒，以95%乙醇溶解，定容于100mL量瓶中。儲存于4℃，冷藏待用。

2.1.2 對照品溶液配制

精密稱取白鮮堿對照品10.81mg，以甲醇溶解，定容在25mL的量瓶中作為對照品母液，濃度為0.4324mg/mL;精密吸取對照品母液2.0mL，以甲醇定容在10mL量瓶中，作為對照品溶液，濃度為0.08648mg/mL。

2.2 指紋圖譜測定方法建立

2.2.1 色譜條件

色譜柱:大連依利特C18色譜柱;流動相A相為乙腈，B相為0.4%磷酸水溶液;梯度洗脫程序:0～10min，A相5%～20%;10～15min，A相20%～30%;15～25min，A相30%～30%;25～40min，A相30%～45%;40～60min，A相45%～65%;60～70min，A相65%～100%;70～75min，A相100%～100%[4]。檢測波長:228nm;流速:1mL/min;溫度:室溫;進樣量:10μL。對照品白鮮堿色譜圖見圖1，指紋圖譜色譜圖見圖2。

2.2.2 精密度試驗

取同一供試品溶液，連續進樣5次，28個共有色譜峰相對保留時間RSD小于3%，28個共有峰面積RSD不超過5%，表明進樣的精密度良好。

2.2.3 重現性試驗

取同一供試品5份，分別按供試品溶液的制備方法制備供試品并測定，28個共有色譜峰相對保留時間RSD小于3%，28個共有峰面積RSD不超過5%，表明其重復性良好。

2.2.4 穩定性試驗

取同一供試品溶液，分別在0，2，4，8，12h檢測，28個共有色譜峰相對保留時間RSD小于3%，28個共有峰面積RSD不超過5%，說明供試品溶液至少在12h內穩定。

2.3 提取溶劑選擇

取白鮮皮藥材粗粉末 (過4號篩)5g，分別用8倍量甲醇、乙醇和0.2%鹽酸水溶液為提取溶媒，超聲30min，按“2.2.1項”下色譜條件測定，根據“2.8項”下計算方法計算，選擇提取溶劑。

2.4 提取方式選擇

取白鮮皮藥材粗粉末 (過4號篩)，等量精密稱取2份，8倍量的以95%乙醇為溶劑，分別用超聲法、回流法提取，制備成等體積的溶液。按“2.2.1項”下色譜條件測定，根據“2.8項”下計算方法計算，選擇提取方式。

2.5 正交試驗法研究白鮮皮提取工藝

對影響醇提取工藝的主要因素溶媒濃度 (因素A)、溶劑用量 (因素B)、提取次數 (因素C)和提取時間 (因素D)進行L9(34)實驗，因素水平見表1。

表1 因素水平表

2.6 樣品測定

取正交實驗法項下的9個供試品溶液吸取20μL，以指紋圖譜測定條件進樣分析，記錄色譜圖。

2.7 評價方法

用多指標實驗公式法進行數據處理[5]。以Xij表示第i次實驗中第j個指標的測定值 (即Xij表示正交實驗的第i次實驗的色譜圖中第j個色譜峰峰面積值，其中在正交實驗各次實驗的色譜圖中所選定的色譜峰是根據活性部位指紋圖譜而確定的，它們相對應的色譜峰的相對保留時間是一致的)，i=1，2，…，n;j=1，2，…，k。首先以各指標的最大值 (即各色譜圖中同一相對保留時間的各色譜峰中峰面積值最大者)作為參照，對同一指標各數據進行標準化處理，Dij表示第j個指標下的第i個測定值的標準化數據。

再按各指標的重要程度和各組數據的相對標準差確定加權系數。以SDj表示第j個指標下Dij的標準差，以RSDj表示第j個指標的相對標準差，則根據各指標相對標準差賦權為RSD/RSDj，其中RSD為指定指標 (參照物白鮮堿)的相對標準差;根據各指標的重要程度賦權為Ej，由于不能確定各組分對藥效的貢獻大小，故認為指紋圖譜中的各個色譜峰 (群)所代表的各組分 (群)都很重要，均設為1。結合各指標的重要程度和各組數據的相對標準差確定的權重系數為:

因此，多指標實驗公式為:

[3]式計算所得的兼顧各指標綜合效應的公式，得分越大越好。

3 結果

表2 正交實驗安排及結果表

3.1 提取溶媒選擇結果

根據實驗數據分析，甲醇、乙醇和0.2%鹽酸水溶液3種提取溶媒的綜合評分分別為56.43372，70.30897，55.69554。故本實驗選擇不同乙醇為提取溶媒。

3.2 提取方式選擇結果

根據對超聲和回流提取方式實驗數據比較，超聲和回流兩種提取方式綜合評分分別為66.73388，71.04552，故本實驗選擇回流為提取方式。

3.3 正交試驗結果

在前述提取條件初篩的基礎上，采用4因素3水平正交實驗法對溶媒濃度、提取溶劑倍量、回流時間、回流次數進行優化研究，試驗設計見表1。將各白鮮皮提取液分別定容至25mL量瓶中，0.45μm濾膜濾過后，用“2.2.1項”色譜法測定各溶液中28個共有峰面積為指標，對數據進行標準化處理，結果及極差分析見表2，方差分析見表3。

表3 公式評分方差分析表

以多指標實驗公式法統計分析P值為考察指標，由表2中極差R值大小顯示，各因素作用主次為A＞D＞C＞B;由表3中方差分析結果表明[6]:因素A具有顯著性差異，以A2B3C1D2組合為佳，即最佳工藝條件為料液比12倍，乙醇濃度75%，提取次數1次，提取時間1.5h。

3.4 驗證試驗

根據正交實驗結果對A2B3C1D2工藝條件重復3次實驗，以驗證該工藝的合理性和穩定性，結果無顯著性差異，RSD值為2.433。最后確定的最佳提取工藝為料液比12倍，乙醇濃度75%，提取次數1次，提取時間1.5h。

4 討論

中藥藥效是多成分、多靶點整體作用的結果，在對中藥的提取工藝優選過程中，若只采用某單體成分含量為優化指標，不能反映全方的整體效應。在以往對中藥的提取工藝研究中，往往只局限于以干浸膏得率、單體含量和化學部位含量為指標進行工藝的優選，具有一定的局限性。本文對白鮮皮醇提工藝優化的過程中，嘗試采用未知結構成分的模糊數據 (特征色譜峰面積之和)相結合的形式，進行多指標綜合評定優化提取工藝，較之于以往可以更全面地反映提取物的成分信息。

盡管指紋圖譜可以提供較為豐富的中藥提取物信息，但是本實驗中采用紫外檢測器，只能提供藥液中具有紫外吸收的成分的相對含量信息;且指紋峰所對應成分的藥效作用尚不完全清楚，在中藥提取工藝的優化方面尚不能實現所有藥效組分的提取與檢測。在未來工作中，有待于結合現代高通量篩選技術，追蹤各成分的藥物活性;同時，可以嘗試建立藥液的液質聯用指紋圖譜，借助質譜等更加靈敏、通用的檢測系統，進行全成分的高效分析、檢測，提高中藥制劑的提取效率和制劑水平，推進中藥研究的現代化進程。

[1]中華人民共和國藥典委員會．中華人民共和國藥典(2010年版)一部 [M]．北京:化學工業出版社，2010:92．

[2]蘇偉梁，靳麗梅．正交法優選白鮮皮的提取工藝[J]．黑龍江醫藥，2006，19(1):16－17．

[3]梁紅，韋寶韓，黃光偉，等．正交試驗法研究白鮮皮的提取工藝 [J]．廣西輕業，2009，12(5):16－17．

[4]杜程芳，屠鵬飛．白鮮皮藥材指紋圖譜研究 [J]．中國天然藥物，2003，1(2):94－98．

[5]韓可勤，楊靜化，劉曉東．藥學應用概率統計[M]．南京:東南大學出版社，2000:1301．

[6]騰海英，祝國強，黃平，等．正交試驗設計實例分析[J]．藥學服務與研究，2008，8(1):75－76．