不同液體復蘇對休克產兔急性肺損傷的影響

林勝謀，王晨虹*，周 洲，盛 超，林賽穆

(1深圳市婦幼保健院，深圳518028;2南方醫科大學附屬南方醫院;3深圳市第四人民醫院)

產后出血是嚴重的分娩期產科并發癥，機體持續的失血將導致組織缺氧和營養物質供應障礙、細胞功能受損，誘發炎癥細胞產生和釋放細胞因子，引起微循環的功能和結構改變，加重缺血—再灌注障礙，出現急性肺損傷(ALI)等并發癥。失血性休克治療過程中，補充血容量是提高心排血量和改善組織灌流的根本措施;由于產后出血多發生在胎兒娩出后24 h內，機體剛經歷了分娩所致的循環和凝血系列變化，此時何種溶液能有效的降低產后出血所致ALI的炎癥損傷，目前研究不多。2007年6月～2009年7月，本研究擬通過實驗動物模型，探討不同溶液復蘇對休克產兔發生ALI炎癥反應變化的差異，為臨床治療產后出血提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 24只新西蘭孕兔由南方醫院動物中心提供，年齡1～1.5歲，妊娠期為15～25 d，體質量2.5～3.5 kg，孕兔產后24 h行休克復蘇試驗。

1.2 動物模型 以3%戊巴比妥鈉(1 ml/kg)耳緣靜脈注入，動物麻醉后游離雙側頸總動脈及頸總靜脈，留置導管，制作產兔失血性休克模型。實驗分為基礎期、休克期、復蘇期3個階段:①基礎期:即失血前期(或產后期);②休克期(0～60min):頸靜脈放血，速率2 ml/(kg·min)，使平均動脈壓(MAP)在15min內降至40 mmHg，維持其在40～45 mmHg 45min;③復蘇期(60～240min):當實驗進行至60min后，縫扎血管徹底止血，開始采用不同的液體復蘇方案(詳見實驗分組)，維持MAP在80 mmHg，復蘇期持續3 h后處死動物，取肺組織做相關實驗。

1.3 實驗分組 將實驗動物編號隨機分為4組，每組6只:①假休克組(SS);給予麻醉，插管處理后，但未進行放血和任何治療。②生理鹽水復蘇組(NS):復蘇期接受小量生理鹽水(0.9%氯化鈉溶液，4 ml/kg)及林格氏液輸注以維持MAP在80 mm-Hg左右;③羥乙基淀粉復蘇組(HES):復蘇期接受小量羥乙基淀粉(4 ml/kg)及林格氏液輸注以維持MAP在80 mmHg左右;④高滲鹽水復蘇組(HS):復蘇期接受小量高滲鹽水(7.5%氯化鈉溶液，4 ml/kg)及林格氏液輸注以維持MAP在80 mmHg左右。

1.4 檢測指標

1.4.1 樣本采集 分別于放血前(0min)、休克期末(60min)、復蘇期間(150min)以及復蘇期末(240min)4個時間點采血測定TNF-α、IL-10;取動物肺組織檢測丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、髓過氧化物酶(MPO)、核因子-κB(NF-κB)活性、干濕質量比(DW/WW)和細胞間黏附因子1(ICAM-1)mRNA表達。

1.4.2 TNF-а、IL-10檢測 用雙抗體夾心酶聯免疫吸附法檢測血清中TNF-а、IL-10含量，按操作流程加樣，終止反應后，選擇450 nm波長檢測吸光度OD值。繪制標準曲線后，根據血清樣品的OD值計算TNF-а、IL-10 濃度。

1.4.3 MDA、SOD測定 采用改良硫代巴比妥酸(TBA)微量法檢測MDA含量，用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性;肺組織勻漿蛋白以考馬斯亮藍法進行定量。

1.4.4 MPO測定 取低溫保存的肺組織100mg，通過H2O2法檢測肺組織勻漿MPO活性。

1.4.5 肺DW/WW測定 新鮮肺組織以120℃烘烤至恒重，根據“(濕重-干重)/濕重”公式計算肺水含量。

1.4.6 檢測NF-κB活性 支氣管肺泡灌洗液以BPS洗滌離心后，用RPMI 1640培養基培養沉淀細胞2～3 h，收集貼壁的巨噬細胞(PAM)接種于24孔培養板孵育4～5 h，提取PAM中核蛋白，并用凝膠電泳遷移率法測NF-κB活性。

1.4.7 ICAM-1 mRNA檢測 按AGPC法提取肺組織總RNA，以RT-PCR法檢測ICAM-1 mRNA。擴增產物經電泳、紫外燈觀察結果并拍照，并經圖像分析處理;以目標條帶OD與內參照光密度比值代表mRNA的量，OD=條帶平均光密度×條帶面積。

1.5 病理學檢查 光鏡下觀察各組肺臟的病理改變。

1.6 統計學方法 應用SPSS13.0統計軟件，各測量值以±s表示，每組不同時間點比較用重復測量方差分析，多重比較采用SNK檢驗法，以P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同液體復蘇休克產兔過程中血清TNF-α、IL-10變化 見表1、2。

2.2 不同液體復蘇休克產兔后肺組織NF-κB活性、ICAM-1 mRNA的差異 見表3。

2.3 不同液體復蘇休克產兔后肺組織MDA、SOD、MPO以及DW/WW的差異 見表4。

2.4 不同液體復蘇休克產兔后肺組織病理變化SS組肺組織病理HE染色顯示大致正常。NS組顯示肺間質水腫，肺泡隔明顯增寬伴中性粒細胞浸潤，肺泡內可見大量蛋白質水腫液及中性粒細胞浸潤。HES組肺組織病理損傷與NS組大致相同。HS組肺組織病理損傷較NS組與HES組減輕，肺泡隔輕度增寬伴中性粒細胞浸潤，肺泡內可見少量中性粒細胞浸潤。見插頁Ⅲ圖16。

表1 各組不同時間點血清TNF-α的變化(±s，n=6)

表1 各組不同時間點血清TNF-α的變化(±s，n=6)

注:與同組休克前比較，*P＜0.05;與NS組、HES組同時間點比較，△P＜0.05

組別 TNF-α 0min 60min 150min 240min SS組100.7±5.7 97.6±3.8 101.4±6.6 99.5±6.2 NS組 97.5±5.3 227.5±13.6* 294.2±19.3* 270.6±18.5*HES組 101.3±6.4 230.2±14.2* 291.4±17.5* 267.7±16.9*HS組 98.8±5.5 232.6±14.8* 276.5±15.8＊△ 236.2±13.4＊△

表2 各組不同時間點血清IL-10的變化(±s，n=6)

表2 各組不同時間點血清IL-10的變化(±s，n=6)

注:與同組休克前比較，*P＜0.05;與NS組、HES組同時間點比較，△P＜0.05

組別IL-10 0min 60min 150min 240min SS組44.3±3.9 42.8±2.5 43.8±3.2 42.7±3.7 NS組 41.7±3.1 112.4±6.8* 152.8±11.0* 132.4±8.8*HES組 41.2±2.8 108.8±6.1* 148.6±10.3* 130.6±7.9*HS組 43.1±2.7 117.2±7.3* 126.5±8.9＊△ 109.6±7.8＊△

表3 各組肺組織細胞NF-κB活性、ICAM-1 mRNA 的差異(±s，n=6)

表3 各組肺組織細胞NF-κB活性、ICAM-1 mRNA 的差異(±s，n=6)

注:與SS組比較，*P＜0.05;與NS組、HES組比較，△P＜0.05

組別 NF-κB OD(450 nm) ICAM-1/GAPDH(%)SS組0.25±0.08 1.1±0.2 NS組 0.87±0.26* 4.8±1.4*HES組 0.81±0.24* 4.4±1.1*HS組 0.58±0.19＊△ 3.2±0.8＊△

表4 各組肺組織MDA、SOD、MPO、DW/W 的差異(±s，n=6)

表4 各組肺組織MDA、SOD、MPO、DW/W 的差異(±s，n=6)

注:與SS組比較，*P＜0.05;與NS組、HES組比較，△P＜0.05

組別MDA(mmol/mgprot)SOD(U/mgprot)MPO(U/L)DW/WW SS組12.6±1.7 194.0±13.6 1.16±0.22 0.116±0.008 NS組 54.6±6.0* 44.5±5.6* 4.77±0.89* 0.203±0.029*HES組 51.2±5.6* 48.2±6.1* 4.15±0.78* 0.187±0.023*HS組 35.4±3.8＊△ 65.7±9.4＊△ 3.08±0.53＊△ 0.134±0.015＊△

3 討論

在產后出血所致ALI的發生發展過程中，除炎癥細胞外，炎癥介質的參與對啟動和維持炎癥反應起著重要的作用。TNF-α是具始動和關鍵性作用的促炎免疫因子，其引起ALI的機制主要有:與肺組織TNF-α受體結合，使溶酶體受損，導致酶外泄引起肺損傷;刺激內皮細胞與中性粒細胞(PMNs)黏附，后者釋放蛋白酶、氧自由基等大量介質發揮毒性作用;刺激單核巨噬細胞合成、釋放IL-1β、IL-6及IL-8等細胞因子及黏附分子，進一步促使PMNs趨化，構成炎性損傷的級聯放大效應［1］。而IL-10則是具有抗炎功能和免疫抑制效應的炎癥介質［2］，具有明顯對抗PMNs等炎癥細胞在肺組織中浸潤的作用，從而減輕ALI的發生。

本研究產兔發生失血性休克等創傷后，機體出現炎癥反應激活，TNF-α、IL-10均增高，提示炎癥反應在高水平臺階進行，且血清炎癥應答存在時限性，應答高峰出現在休克后第250min。比較不同溶液的復蘇效應，在休克復蘇后150min、240min時間點，HS組 TNF-α、IL-10均低于 NS組與 HES組，提示高滲鹽水能顯著減少炎癥反應中炎癥因子的產生，效果較羥乙基淀粉與生理鹽水更為明顯。

在各種致病因素所導致的ALI中，缺血再灌注損傷與機體炎癥應答是重要的發生機理，兩者相輔相成構成了炎癥“瀑布效應”和組織細胞損傷。聯合檢測SOD、MDA，反映了缺血再灌注時體內氧自由基的產生和清除水平，其含量可間接了解肺組織缺血再灌注損傷程度［3］。而PMNs是機體發揮正常防御和免疫功能不可缺少的一種炎癥細胞。在創傷、休克等情況下，PMNs在肺內聚集、激活，并通過“呼吸爆發”釋放氧自由基、蛋白酶和炎癥介質，引起肺組織急性炎癥損傷。MPO是中性粒細胞所特有的還原酶，測定肺組織MPO可判斷PMNs的活化程度。

與其他病因類似，產后出血所致ALI的炎癥應答程度受眾多因素調節，NF-κB與ICAM-1便是重要的兩個方面。NF-κB是一種核轉錄因子，調控重要的細胞因子、黏附分子和趨化因子以及參與炎癥反應放大與延續的多種酶的轉錄，在啟動免疫應答、調節炎癥反應過程中發揮關鍵作用［4，5］。同時，炎癥激活時，巨噬細胞通過TNF-α刺激肺血管內皮細胞表面間黏附因子ICAM-1表達上調，參與炎癥反應的調節［6］。

本研究產兔發生失血性休克后，肺組織MDA、MPO、ICAM-1及NF-κB活性顯著升高，SOD明顯降低，提示炎癥在應答水平及調控水平均激活。比較不同溶液的復蘇效應顯示，高滲鹽水能減輕產兔肺組織的炎癥應答，與非產后動物模型有類似保護效應［7］。具體表現在:①在信號轉錄水平，NF-κB介導炎癥刺激活性降低;②肺組織的ICAM-1細胞黏附分子表達減少，減少了PMNs滯留于肺微血管和組織間隙;③肺組織細胞MPO減少，提示PMNs的活化程度降低;④肺組織SOD活性增強，增強了清除氧自由基的能力;⑤脂質過氧化物及其降解產物MDA減少。產兔分子生物學的改變在肺組織病理上同樣得到了證實，HS組ALI出現間質水腫程度和炎癥浸潤程度都較其他2組輕。

由于產后出血在產褥期并不罕見，研究液體復蘇的機制有重要的意義［8］。高滲鹽水復蘇產兔對ALI的保護機制目前尚不明確，但基于上述實驗結果，以下作用機理可能參與其中:①在動員細胞內液的同時擴充了血漿容量和組織間液體容量，減少了缺血再灌注損傷;②通過 NF-κB調控機制，減少TNF-α等炎癥因子的產生或釋放，減輕炎癥應答;③參與了對免疫功能和炎癥反應的調節，減少肺組織內ICAM-1所誘發的PMNs聚集［7］，從而減輕了脂質過氧化作用;④降低了PMNs的活化程度，提高了清除氧自由基的能力。

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