HCV NS5A結(jié)合蛋白順烏頭酸酶1的驗(yàn)證研究

王曉杰，相久全，韓樂(lè)強(qiáng)，張錦前*，成 軍

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院，北京100015;2密云縣第二醫(yī)院;3大連市第六人民醫(yī)院)

HCV與肝臟脂肪變性、糖代謝異常、2型糖尿病等代謝類(lèi)疾病密切相關(guān)［1］，肝臟脂肪變性與慢性丙型肝炎(CHC)疾病進(jìn)展也有關(guān)［2，3］。近年研究發(fā)現(xiàn)HCV NS5A可能是肝臟脂肪變性及HCC發(fā)生發(fā)展的間接機(jī)制［4］。2009年9月～2010年9月，我們應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)篩選肝臟cDNA文庫(kù)中HCV NS5A的結(jié)合蛋白，并對(duì)這些蛋白的相互作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為HCV影響糖、脂類(lèi)代謝的分子生物學(xué)機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)和方向。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細(xì)胞系 HepG2、pGBKT7-HCV NS5A、pcDNA3.1(-)-HCV NS5A、pcDNA3.1(-)-myc-his、pBIND-HCV NS5A、載 體 由 本室 保 存。DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司;酵母雙雜交所需各種培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Clontech公司;anti-HCV NS5A及anti-his單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000、哺乳動(dòng)物雙雜交試劑盒(包括實(shí)驗(yàn)所需質(zhì)粒)、Dual-Luciferase?雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Promega公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，引物合成及DNA測(cè)序由北京奧科生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 pGBKT7-HCV NS5A轉(zhuǎn)化酵母菌株并進(jìn)行鑒定 誘餌質(zhì)粒pGBKT7-HCV NS5A由本所構(gòu)建保存，將前述質(zhì)粒用醋酸鋰法轉(zhuǎn)導(dǎo)入酵母菌株AH109，隨后鋪平板(SD/-Trp培養(yǎng)基)，隨機(jī)挑取直徑＞2 mm的菌落PCR鑒定。

1.2.2 酵母菌株Y187(肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化)與酵母菌株AH109(pGBKT7-HCV NS5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)化)配合 前述鑒定正確的AH109酵母接種于一缺培養(yǎng)基中，30℃振搖至A600為0.8～1.0后重懸于50 ml 2×YPDA培養(yǎng)基中，與4 ml含肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)的酵母細(xì)胞于搖床中30℃輕微振搖培養(yǎng)配合48 h。顯微鏡下觀(guān)察到三葉草二倍體細(xì)胞后，離心將其酵母菌重懸于0.25×YPDA培養(yǎng)基，鋪三缺及四缺培養(yǎng)板各50塊，于孵箱中以30℃培養(yǎng)16 d后，再把直徑＞2 mm的菌落于鋪有X-α-gal的四缺培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，生長(zhǎng)且呈藍(lán)色的為二者蛋白結(jié)合的所篩選陽(yáng)性的克隆。

1.2.3 陽(yáng)性質(zhì)粒的分析 在四缺培養(yǎng)基上挑取前述陽(yáng)性克隆，于搖床中30℃劇烈振搖培養(yǎng)5 d后離心，提取酵母菌的質(zhì)粒，電穿孔法轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌，隨后于含氨芐LB平板上培養(yǎng)。再提取前述菌落質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定，認(rèn)定正確后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與PUMED中的已知基因序列比對(duì)分析。

1.2.4 構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-3.1(-)-mychis-aconitase1 根據(jù)人順烏頭酸酶1(aconitase1)基因序列(Gene Bank accession:NM_002197.2)，在編碼區(qū)上游和下游設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物(兩端分別引入XhoⅠ和HindⅢ限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)):(上游:5'-CTCGAGATGAGCAACCCATTCGCAC-3';下游:5'-AAGCTTCTTGGCCATCTTGCGGATC-3')。TRIzol法提取HepG2細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄制備成cDNA模板，隨后用前述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終獲得aconitase1基因的全長(zhǎng)序列。經(jīng)電泳鑒定后回收純化，產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，再轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，鋪LB培養(yǎng)板37℃過(guò)夜。第2天挑取平板上單克隆菌再培養(yǎng)過(guò)夜后，提取質(zhì)粒行XhoⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果正確者再純化回收，與 XhoⅠ/HindⅢ雙酶切 pcDNA3.1-myc-his空載體連接，再行轉(zhuǎn)化鋪于LB/Amp固體平板，37℃過(guò)夜孵育后，提取質(zhì)粒DNA后以XhoⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定。

1.2.5 細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染 以10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO2條件培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，每3 d傳代一次。轉(zhuǎn)染前2 d，以1×106細(xì)胞/孔密度接種培養(yǎng)板。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒設(shè)為實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，每孔轉(zhuǎn)染8 μg質(zhì)粒DNA。

1.2.6 免疫共沉淀(CO-IP) 各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，提取各孔細(xì)胞的總蛋白，行CO-IP:細(xì)胞用PBS洗2次;各孔中加入冰預(yù)冷的非變性細(xì)胞裂解液(1%PMSF)完全裂解細(xì)胞;抽提細(xì)胞蛋白，收集上清;前述上清中加入Protein-G/A Beads，4℃搖床緩慢振搖4 h后離心收集上清;上清中再加入anti-his單抗后4℃緩慢振搖過(guò)夜;隨后EP管中再加入適量Protein-G/A Beads，此后再慢搖12 h;離心后棄上清;沉淀中加入5×SDS Buffer，煮沸15min;離心后收集上清。

1.2.7 SDS-PAGE及Western blot驗(yàn)證CO-IP蛋白蛋白樣SDS-PAGE膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，質(zhì)粒pcDNA 3.1(-)HCV NS5A單轉(zhuǎn)染組、實(shí)驗(yàn)組及陰性對(duì)照組各組使用同種單抗，即anti-HCV NS5A的單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4℃過(guò)夜封閉。二抗使用HRP-IgG(1∶1 000稀釋)，搖床上室溫?fù)u1 h后，洗膜，壓片后再顯影及定影。

1.2.8 哺乳動(dòng)物雙雜交(Mammalian Two-Hybrid)試驗(yàn) HepG2細(xì)胞培養(yǎng)后接種于12孔板后再培養(yǎng)48 h。每孔2 μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，共分如下各組:空細(xì)胞組;陰性對(duì)照組1(質(zhì)粒 pACT、pBIND、pG5Luc共轉(zhuǎn)染);陰性對(duì)照組2(質(zhì)粒 pACT-aconitase1、pBIND、pG5Luc共轉(zhuǎn)染);陰性對(duì)照組3(質(zhì)粒pACT、pBINDHCV NS5A、pG5Luc共轉(zhuǎn)染);陽(yáng)性對(duì)照(pG5Luc、pACT-myoD、pBIND-Id共轉(zhuǎn)染);實(shí)驗(yàn)組(質(zhì)粒pACT-aconitase1、pBIND-HCV NS5A、pG5Luc 共轉(zhuǎn)染)。轉(zhuǎn)染48 h后裂解細(xì)胞，雙熒光素酶活性檢測(cè)，數(shù)據(jù)取兩種酶檢測(cè)值的比值(即Firefly Luciferase和Renilla Luciferase兩種熒光值)。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件，全部數(shù)據(jù)以±s表示，比較多個(gè)樣本均數(shù)采用方差分析，多個(gè)樣本均數(shù)兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人肝臟cDNA文庫(kù)中HCV NS5A結(jié)合蛋白的酵母雙雜交篩選 人肝臟cDNA文庫(kù)蛋白與HCV NS5A蛋白結(jié)合使相應(yīng)酵母配合，此時(shí)可在顯微鏡下觀(guān)察到三葉草狀二倍體細(xì)胞(圖1)。三缺和四缺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出多個(gè)克隆，在鋪有X-α-gal的四缺培養(yǎng)基上長(zhǎng)出8個(gè)陽(yáng)性克隆。篩選出的肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序與同源性分析(根據(jù)PUMED數(shù)據(jù)庫(kù))，發(fā)現(xiàn)其中兩個(gè)克隆為aconitase1。

2.2 Western blot結(jié)果 成功表達(dá)HCV NS5A(圖2)及aconitase1蛋白(圖3)(實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果均一致)，并證實(shí)HCV NS5A與aconitase1蛋白在肝細(xì)胞HepG2內(nèi)存在相互作用(圖4)(實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果均一致)。

2.3 Mammalian Two-Hybrid實(shí)驗(yàn)結(jié)果 將各組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后48 h，檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性值。實(shí)驗(yàn)組的相對(duì)熒光素酶活性值(0.012 8±0.001 2)高于陰性對(duì)照組1(0.003 3±0.000 5)、陰性對(duì)照組2(0.004 2±0.000 8)、陰性對(duì)照組3(0.004 7±0.001 2)，P均 ＜0.05。因此，本實(shí)驗(yàn)證實(shí) HCV NS5A與人aconitase1蛋白在肝細(xì)胞HepG2內(nèi)存在相互作用關(guān)系。

3 討論

有關(guān)慢性HCV感染多年的臨床流行病學(xué)及實(shí)驗(yàn)研究資料表明，CHC常伴有糖尿病、脂肪肝等代謝性疾病;CHC與這些代謝性疾病的發(fā)生密切相關(guān)［5］，肝臟脂肪變性及胰島素抵抗(IR)可能是HCV引發(fā)代謝綜合征的中心環(huán)節(jié)，其分子生物機(jī)制是病毒導(dǎo)致的脂代謝紊亂。糖、脂代謝異常則加重IR，三者之間關(guān)系密切、互為因果、也可能相互促進(jìn)，其中 IR 可能是中心環(huán)節(jié)［6，7］。

aconitase為三羧酸循環(huán)中的酶，催化檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕帷幟仕岜旧聿灰籽趸赼conitase作用下，通過(guò)脫水與加水反應(yīng)，使羥基由β碳原子轉(zhuǎn)移到α碳原子上，生成易于脫氫氧化的異檸檬酸，為進(jìn)一步的氧化脫羧反應(yīng)作準(zhǔn)備。aconitase是為細(xì)胞提供能量的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞代謝方面也起關(guān)鍵作用。

本研究我們通過(guò)酵母雙雜交篩選出HCV NS5A在肝細(xì)胞內(nèi)與之可能存在相互作用的蛋白基因，并進(jìn)一步通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)(Mammalian Two-Hybrid及CO-IP實(shí)驗(yàn))證實(shí)了HCV NS5A與aconitase蛋白存在相互作用關(guān)系，為HCV感染合并2型糖尿病、脂肪肝等代謝性疾病的分子生物學(xué)機(jī)制的研究提供了一定的線(xiàn)索和研究思路。但HCV NS5A與aconitase蛋白的結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合方式，對(duì)aconitase功能以及進(jìn)一步影響細(xì)胞代謝過(guò)程等一系列分子生物學(xué)機(jī)制尚未完全清楚，有待更為深入的研究。

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