松茸多糖對不同腫瘤細胞系的體外抗腫瘤作用

張治業

(河南科技大學第一附屬醫院，河南洛陽 471003)

松茸屬擔子菌亞門、層菌屬、傘菌目、口蘑科、口蘑屬，具有很高的營養價值和藥用價值。松茸含有多糖、氨基酸、蛋白質、多肽、萜類以及多種酶，國內外對其多糖雖有報道[1～3]，但缺乏系統分析研究。2010年 10～12月，我們提取松茸多糖組分，并檢測其對人神經膠質瘤細胞系(U87)、人宮頸癌(He-La)、人胰腺導管上皮癌(PANC-1)以及人乳腺癌細胞系(MCF-7)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料 二氧化碳培養箱(美國 Forma公司)，Thermo Multiskan MK3酶標儀(美國 Thermo公司)，5417R型臺式高速冷凍離心機(德國 Eppendorf公司)，F-4500紫外分光光度計(日本 Hitachi公司)，FACSCalibur流式細胞儀(美國 Becton Dickinson公司)，CKX41倒置顯微鏡(日本 Olympus公司)，2720型 PCR儀 (美國 Applied Biosystems公司)，Tannon水平及垂直電泳槽(上海天能科技有限公司)，Tanon 3500凝膠圖像分析系統(上海天能科技有限公司)。DMEM培養基購自 Thermo公司，RPMI-1640培養基 (美國 Gibco公司 )，胎牛血清 (FBS，杭州四季青公司)。U87以及 MCF-7細胞系購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，其他試劑為國產分析純等。Trizol試劑(美國 Invitrogen公司)，MMMV逆轉錄酶和 Ex Taq酶(日本 TaKaRa公司)，p53、18SRNA引物(上海生工生物工程技術有限公司合成)，二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶 (PI)和RNase以及其他常用生物試劑購自 Sigma公司(Sigma，USA)。松茸多糖由本實驗室根據文獻[4]自松茸中提取，松茸多糖用培養基配成 200μg/ml的儲存液，使用前用培養基稀釋到所需濃度。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 U87、PANC-1、MCF-7細胞用含10%FBS的 DMEM培養，HeLa細胞用含 10%FBS的 RPMI-1640培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2 MTT法測定細胞生長 將處于對數生長期細胞接種于 96孔微量培養板內，培養 24 h待細胞貼壁后加入不同濃度的松茸多糖，每個濃度設 3個復孔(邊緣孔不加樣品，以避免“邊緣效應”)，并設相應濃度的溶媒(即不加樣品，僅加相應體積的樣品溶解液)對照及無細胞調零孔。藥物與細胞在 37℃、5%CO2條件下共孵育 48 h后加入 MTT，置培養箱中反應 4 h，棄去孔中培養基和 MTT后加入 150 μl/孔的 DMSO，震蕩溶解生成的紫色結晶后立即用酶標儀在 570 nm和 630 nm波長處檢測 96孔平板中每孔細胞的光密度值(OD值)，測定波長為 570 nm，校正波長為 630 nm，所得值再減去空白的吸光度。按照公式(1-OD處理組/OD對照組)×100%計算腫瘤生長抑制率。

1.2.3 流式細胞術分析細胞周期 細胞經松茸多糖處理一定時間后，胰酶消化收集細胞，4℃固定在預冷的 70%乙醇中。檢測前離心棄去固定液，用PBS洗 2遍后，將細胞重懸在含 50 mg/L RNase和50 mg/L PI的 PBS中 ，調整細胞數為 1×106個 /ml，室溫置暗處染色 30 min，300目尼龍膜過濾后用流式細胞儀檢測 DNA含量，采用 ModiFit軟件進行細胞周期分析。

1.2.4 半定量 RT-PCR分析 細胞經松茸多糖處理一定時間后，用 Trizol試劑依照說明提取總 RNA，取 1μg RNA用 M-MLV逆轉錄酶和隨機引物合成cDNA。采用 p53引物進行 PCR反應擴增目的基因。PCR反應條件為 95℃變性 50 s，56℃退火 50 s，72℃延伸 55 s，p53為 30個循環，18S RNA為 25個循環。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，用計算機圖像掃描分析系統測定電泳條帶光密度值，p53表達水平以該條帶密度與 18SRNA的百分比(%)表示。

1.3 統計學方法 采用 SPSS12.0統計學軟件，數據以±s表示 ，組間比較采用 t檢驗 。 P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 松茸多糖對 U87、HeLa、PANC-1以及 MCF-7細胞影響 不同濃度的松茸多糖(高、中、低劑量組)均能夠抑制 4種細胞，抑制率隨著濃度增大而增大。見表1。

表1 松茸多糖對 U87、HeLa、PANC-1、MCF-7細胞活性的影響

2.2 松茸多糖對 U87、HeLa、PANC-1以及 MCF-7細胞周期的影響 U87經 24.04μg/ml、HeLa經19.6 μg/ml、PANC-1經 21.3 μg/ml以及 MCF-7經18.9μg/ml松茸多糖處理 48 h后，細胞周期發生明顯的變化，G1、G2期細胞減少，S期細胞增多。與空白對照組相比，松茸多糖處理后，4種細胞 S期細胞分別增多了 11.37%、8.48%、9.36%和 11.11%。表明松茸多糖處理可使 U87、HeLa、PANC-1以及MCF-7細胞阻滯于 S期。

2.3 松茸多糖對 U87、HeLa、PANC-1以及 MCF-7細胞p53 mRNA表達的影響 U87經 24.04μg/ml、HeLa經19.6 μg/ml、PANC-1經 21.3 μg/ml以及 MCF-7細胞經18.9μg/ml松茸多糖處理 48 h后，p53 mRNA的表達結果見圖1。顯示松茸多糖能夠上調 p53 mRNA表達水平，與對照組相比有統計學差異(P＜0.01)。

圖1 松茸多糖對 U87、HeLa、PANC-1以及MCF-7細胞 p53m RNA表達的影響

3 討論

松茸富含粗蛋白、粗脂肪、粗纖維和維生素 B1、B2、維生素 PP等元素[5]，不但味道鮮美，而且還具有益腸胃、理氣化痰、驅蟲及對糖尿病有獨特療效等功能，是中老年人理想的保健食品[6]。松茸多糖為從松茸中提取的大分子多糖類物質，具有抗腫瘤、保肝和免疫佐劑以及對環磷酰胺誘發損傷的拮抗作用和抗炎活性[7，8]。

誘導腫瘤細胞周期阻滯是抗腫瘤作用的主要機制之一。已有研究表明，許多參與調控細胞周期的蛋白和基因都與細胞周期阻滯密切相關，如腫瘤抑制基因 p53。目前為止，p53基因是研究最透徹、功能最強大的一種抑癌基因，其作為一種轉錄因子能促進或抑制很多與細胞周期及凋亡相關基因的表達。當 DNA受到損傷時，p53蛋白表達產物急劇增加，可抑制細胞周期進一步運轉。一旦 p53基因發生突變，p53蛋白失活，細胞分裂失去節制，則會發生癌變。人類癌癥中約有一半是由于 p53基因發生突變失活引起。

本研究顯示，松茸多糖能夠誘導 U87、HeLa、PANC-1以及 MCF-7細胞生長以及細胞周期的 S期阻滯。其機制可能是松茸多糖通過上調 p53基因誘導細胞周期阻滯從而抑制腫瘤細胞的生長。

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