息賁膠囊對小鼠 Lewis肺癌組織 Caspase-3、Bcl-2和 Bax表達的影響

孫長崗 ，杜忠海 ，賀珊珊

(1山東中醫藥大學，濟南 250012;2濰坊市中醫院;3濰坊醫學院)

研究表明，息賁膠囊聯合化療治療中晚期非小細胞肺癌能夠明顯降低化療毒副反應，提高患者生活質量，延長生存期[1]。息賁膠囊能夠抑制腫瘤細胞 DNA合成和復制，降低端粒酶活性，調節機體免疫力，進而阻滯 Lewis肺癌細胞增殖過程[2]。2010年 6～8月，我們通過觀察息賁膠囊對小鼠 Lewis肺癌組織 Caspase-3、Bcl-2和 Bax表達的影響，進一步揭示其抗腫瘤的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料 C57BL/6小鼠(H-2Kb)77只，雄性，6～8周齡，體質量(20±2)g，購自中國科學院上海實驗動物中心。SW-CJ-1F型超凈工作臺(蘇凈集團安全公司產品)、TGL-40B離心機(上海安亭科學儀器廠產品)、HP2AS-1000高清晰度彩色病理圖像分析系統(軟包購自武漢同濟醫科大學千屏影像工程公司)、37℃電熱恒溫水浴箱(上海恒豐儀器儀表有限公司產品)、恒溫冰凍切片機(德國 Leica公司產品)。Lewis肺癌細胞株購自中國科學院上海生命科學院生物化學與細胞生物學研究所;RPMI-1640培養基購自 Gibco公司;小鼠 Bax、Bcl-2單克隆抗體和 Caspase-3單克隆抗體均為 NeoMarkers生物技術公司產品;免疫組化 SABC試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。實驗用藥為息賁膠囊(由濰坊市中醫院制劑中心生產，每粒 1.0 g，相當于生藥 5 g)、順鉑(齊魯制藥有限公司，國藥準字:H37021357，20 mg/支)。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 取接種 Lewis肺癌 10～14天的 C57BL/6荷瘤小鼠，脫頸椎處死，無菌條件下取瘤組織，按腫瘤質量(g)與生理鹽水(ml)1∶3制備瘤細胞懸液，200目細胞篩過濾，1 500 r/min離心5 min，用生理鹽水調成濃度約 1×107/ml腫瘤細胞。取 77只小鼠，在右前腋皮下接種 Lewis肺癌瘤細胞懸液，每只 0.2 ml。

1.2.2 動物分組及處理方法 接種 24 h后，將小鼠分別按體質量標號，隨機數字表法將 77只小鼠完全隨機分為 5組:生理鹽水組 16只、息賁膠囊低劑量[25 g/(kg? d)]組 16只、息賁膠囊中劑量[37.5 g/(kg? d)]組 15只、息賁膠囊高劑量[50 g/(kg?d)]組 15只、順鉑組 15只。各組小鼠于用藥第 21天脫頸處死，剝取瘤塊，切取部分腫瘤組織，浸于10%甲醛溶液固定，48 h內常規石蠟包埋。

1.2.3 Caspase-3、Bcl-2和 Bax表達檢測 采用SABC法，依據試劑盒說明書方法操作，顯微鏡下觀察，應用圖像分析系統記錄各自的積分光密度值(IOD值)作為蛋白表達的量化指標。每張切片用顯微鏡圖像采集系統采集圖像，并用 Image-Pro Plus 5.0圖像分析系統進行陽性顯色的平均 IOD測定，平均 IOD=平均光密度 ×表達面積。

1.3 統計學方法 采用 SPSS11.0統計軟件，數據結果以±s表示，組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

在實驗過程中，生理鹽水組及息賁膠囊低劑量組各有 1只小鼠灌胃死亡，生理鹽水組另有 1只小鼠第 18天時死亡。各組小鼠瘤組織中均有不同程度 Bcl-2、Bax和 Caspase-3蛋白表達。與生理鹽水組比較，各息賁膠囊組 Bax和 Caspase-3蛋白表達均上調，Bcl-2蛋白表達下調，Bax/Bcl-2比值升高(P＜0.05或 ＜0.01)，而且效應與劑量呈正相關(r=0.625，P＜0.05)。見表1。

表1 小鼠 Lewis肺癌組織中 Caspase-3、Bcl-2和 Bax蛋白表達(±s)

表1 小鼠 Lewis肺癌組織中 Caspase-3、Bcl-2和 Bax蛋白表達(±s)

注:與生理鹽水組比較，*P＜0.05，**P＜0.01;與順鉑組比較，△P＜0.01;與息賁膠囊高劑量組比較，★P＜0.01;與息賁膠囊中劑量組比較，●P＜0.05

組別 n Bax(×103) Bcl-2(×103) Bax/Bcl-2 Caspase-3(×103)生理鹽水組 14 1.98±0.23 12.36±1.14 0.15±0.02 2.59±0.17息賁膠囊低劑量組 15 2.72±0.17*★●△ 5.90±0.29**★△ 0.44±0.03**★△● 3.31±0.25*★△息賁膠囊中劑量組 15 3.40±0.32**★△ 4.49±0.26**★△ 0.75±0.09**★△ 3.75±0.42*★△息賁膠囊高劑量組 15 19.92±1.17** 2.49±0.47** 8.02±0.47** 8.13±0.46**順鉑組 15 17.37±0.69** 2.12±0.31** 6.31±0.35** 7.69±0.37**

3 討論

Bcl-2家族是細胞凋亡重要的調控者，包括抑凋亡基因如 Bcl-2和促凋亡基因如 Bax。Bcl-2和 Bax均通過調控內質網 Ca2+參與的核內外物質轉運及膜通透性轉換來控制細胞色素 C從線粒體中釋放，進而阻滯或誘導凋亡，Bcl-2與 Bax的比值可以決定細胞是否凋亡[3，4]。Bax/Bcl-2升高則細胞凋亡，反之細胞存活的可能性增大。

Caspase家族是一類半胱氨酸蛋白酶，在細胞凋亡過程中起著重要作用。Caspase-3被合成后通常以無活性的酶原形式存在于細胞質中，在多種凋亡信號刺激下經蛋白水解作用被激活，可對多種蛋白底物進行降解，從而在細胞凋亡過程中起關鍵作用，是 Caspase家族中最重要的凋亡執行者之一，參與多種因素誘導的細胞凋亡，抑制 Caspase-3的活性或拮抗其功能可使細胞凋亡受抑。當接收到細胞凋亡信號的刺激，Bcl-2/Bax比值變小，使線粒體外膜通透性升高，引起細胞色素 C釋放到胞質中，激活Apaf-1，進而活化 Caspase-3啟動凋亡。

本研究顯示，與生理鹽水組比較，息賁膠囊治療組 Bax和 Caspase-3蛋白表達均上調，Bcl-2蛋白表達下調，Bax/Bcl-2比值升高;息賁膠囊高劑量組及順鉑組與中、低劑量組比較各指標均有統計學意義。表明息賁膠囊能下調 Bcl-2蛋白的表達，上調 Bax和 Caspase-3蛋白表達，誘導腫瘤細胞凋亡。至于息賁膠囊是否同時通過其他機制抑制肺癌組織的生長，尚有待進一步研究探討。

[1]杜忠海，孫長崗，鄭華.息賁膠囊聯合 GP方案治療中晚期非小細胞肺癌的臨床觀察[J].河北中醫，2006，28(10):728-730.

[2]杜忠海，牛術仙，鄭萍萍.息賁膠囊抗腫瘤生長及免疫調節機制的實驗研究[J].山東中醫雜志，2007，26(9):632-633.

[3]張甘霖，王笑民，李萍，等.固本抑瘤Ⅱ號對 Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫功能的影響[J].中華中醫藥學刊，2007，25(3):489-492.

[4]Lee JU，Hosotani R，Wada M，et al.Role of Bcl-2 family proteins(Bax，Bcl-2 and Bcl-x)on cellular susceptibility to radiation in pancreatic cancer cells[J].Eur J Cancer，1999，35(9):1374-1380.