膀胱移行細(xì)胞癌 E2F3、miR－17－5p、miR－20a 的表達(dá)及相關(guān)性分析

任海林，孫 巖，李世斌，韓瑞發(fā)

(天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院天津市泌尿外科研究所，天津300211)

miR－17－5p 和 miR－20a 是 mir－17－92 基因簇產(chǎn)物，通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默效應(yīng)調(diào)控多種抑癌基因或癌基因的表達(dá)，在不同的腫瘤中起抑癌基因或癌基因的作用。E2F3屬于轉(zhuǎn)錄因子E2F家族，在膀胱癌中有擴(kuò)增和過表達(dá)［1］，E2F3有很強(qiáng)的促進(jìn) mir－17－92 基因簇啟動子活性作用，并誘導(dǎo) mir－17－92 基因簇表達(dá)［2，3］。我們期望通過研究 E2F3、miR－17－5p和miR－20a在膀胱癌組織中的表達(dá)情況，闡明E2F3、miR－17－5p 和 miR－20a 之間是否存在相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料 膀胱組織標(biāo)本選用我院2009年10月～2010年2月行膀胱全切或部分切除術(shù)的20例膀胱組織，并經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)為膀胱移行細(xì)胞癌，新鮮組織獲得后立即放置于－80℃超低溫冰箱。患者術(shù)前均未行放療、化療與免疫治療。其中男16例、女4例，年齡43～81歲、平均58.15歲。組織病理分級按照WHO(1973年)分級標(biāo)準(zhǔn)，其中G1級10例，G2級4例，G3級6例。另取10例開放前列腺摘除術(shù)患者的正常膀胱黏膜組織作為對照。膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系5637、T24購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，在含10%小牛血清RPMI－1640培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。總RNA提取試劑盒購自申能博彩生物科技有限公司;cDNAD第一鏈合成試劑盒購自 QIAGEN 公司;E2F3、miR－17－5p、miR－20a熒光探針和內(nèi)參GAPDH、U6熒光探針，2×PCR TaqMan?Universal PCR，TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription ki均購自 ABI公司;鼠抗人E2F3和GAPDH抗體購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 基因的表達(dá)檢測 取凍存組織和膀胱移行細(xì)胞癌細(xì)胞系5637、T24，放于DEPC處理的1.5 ml EP管中。加組織裂解液后，應(yīng)用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)粉碎組織，按試劑盒說明提取總RNA。按cDNAD第一鏈合成試劑盒說明用提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNAD，按2×PCR TaqMan?Universal PCR說明，以第一鏈cDNAD為模板、E2F3和GAPDH熒光探針為引物擴(kuò)增，反應(yīng)條件:95℃變性10 min，95℃復(fù)性15 s，60 ℃延長 1 min，共40 個循環(huán);按 TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription kit操作手冊說明，以提取的總 RNA 為模板，用 miR－17－5p、miR－20a 和 U6 逆轉(zhuǎn)錄引物(5×TaqMan?Gene Expression Assay Mix)逆轉(zhuǎn)錄合成 miR－17－5p、miR－20a 和 U6 第一鏈，反應(yīng)條件:16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃延長5 min;然后按2×PCR TaqMan?Universal PCR試劑盒說明，以miR－17－5p、miR－20a 和 U6 第一鏈為模板，用 miR－17－5p、miR－20a和U6熒光探針(10 ×TaqMan?Gene Expression Assay Mix)為引物擴(kuò)增;以上熒光PCR檢測均在7900HT型熒光定量PCR儀(ABI公司)操作完成，檢測方法為相對定量分析2－ΔΔCt法，每個樣品每次試驗至少設(shè)立3個重復(fù)，重復(fù)3次試驗。

1.2.2 檢測E2F3蛋白變化 取不同病理分級組織、正常黏膜對照組織適量，加組織裂解液后超聲細(xì)胞粉碎機(jī)粉碎組織，13 000 g離心3～5 min，取上清液。用SDS－PAGE電泳(5%層積膠，12%分離膠)，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的TBS封閉過夜，一抗于4℃孵育4 h，TBS洗滌3次×5 min;辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗于室溫孵育2 h，TBS洗滌3次×5 min，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育5～10 min，經(jīng)X線片曝光、顯影、定影。用凝膠成像分析軟件BandScan 5.0進(jìn)行灰度分析。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理，所得數(shù)據(jù)均以±s表示，3組樣本以上計量資料用方差分析，多樣本均數(shù)間的多重比較用Dunnett－t檢驗。以P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

各組 E2F3、miR－17－5p 及 miR－20a 表達(dá)水平比較見表1。

表1 E2F3、miR-17-5p 及 miR-20 相對定量(2－ΔΔCt)分析結(jié)果(ˉx ±s)

3 討論

E2F3參與調(diào)控細(xì)胞周期與DNA復(fù)制，可以促進(jìn)循環(huán)細(xì)胞的 G1/S 期轉(zhuǎn)換［4］。Feber等［1］檢測了TCCSUP、5637和HT1376 3種膀胱癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)在這3種細(xì)胞系中E2F3的mRNA過表達(dá)，均有高水平的E2F3蛋白質(zhì)生成。本試驗也發(fā)現(xiàn)膀胱癌組織E2F3的mRNA和蛋白相對正常膀胱組織都呈高表達(dá)狀態(tài)，E2F3蛋白有隨著病理分級的升高而升高的趨勢。綜上所述，可以推斷E2F3是一種能促發(fā)膀胱癌的癌基因。

本研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌細(xì)胞系中，高分化的5637較低分化的T24高表達(dá)E2F3蛋白，這與癌組織是正好相反的，這與Feber等［1］的研究是一致的，這一現(xiàn)象說明不同來源的組織和細(xì)胞其基因的表達(dá)和調(diào)控是不同的，也充分說明了基因調(diào)控的復(fù)雜性。miRNA在基因組上的分布是成簇的，同一基因簇內(nèi)的miRNA作為一個整體，通過一個共同的啟動子被轉(zhuǎn)錄，然后經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)錄后加工形成不同的單體miRNA［5］。mir－17－92 是 miRNA 家族中一組多順反子簇，包含了 7 個成熟的 miRNA:miR－17－5p、miR－17－3p、miR－18、miR－19a、miR－20a、miR－19b－1 和 miR－92－1［6］。已有研究認(rèn)為，E2F3 有很強(qiáng)的誘導(dǎo) mir－17－92基因簇表達(dá)、并促進(jìn) mir－17－92基因簇啟動子活性作用［3］，研究同時也證實(shí)，mir－17－92 基因簇產(chǎn)物miR－17－5p 和 miRNA－20a 可以調(diào)節(jié) E2F3 的蛋白表達(dá)［7］。這樣 mir－17－92、E2F3 就形成了一個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。以 mir－17－92 和 E2F1、E2F2、E2F3 為核心的反饋調(diào)控環(huán)路已在淋巴瘤、前列腺癌、宮頸癌［8］等腫瘤中證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn) miR－17－5p和 miR－20a相對正常膀胱組織都呈高表達(dá)狀態(tài)，miR－20a有隨著病理分級的升高而降低的的趨勢，miR－17－5p、miR－20a的表達(dá)與E2F3的增高有某種程度的相關(guān)性。E2F3是促發(fā)膀胱癌的癌基因，miRNA是一類負(fù)調(diào)控其他蛋白質(zhì)編碼基因的基因，在不同的腫瘤中起抑癌基因或是癌基因的作用，由此推斷:癌基因E2F3高表達(dá)誘導(dǎo)并促進(jìn) mir－17－92基因簇轉(zhuǎn)錄，其產(chǎn)物 miR－17－5p、miR－20a抑制 E2F3蛋白表達(dá)的進(jìn)一步升高，使E2F3的表達(dá)維持在適當(dāng)?shù)姆秶琺iR－17－5p 和miR－20a在膀胱癌中可能是一種腫瘤抑制因子。

綜上所述，E2F3、miR－17－5p、miR－20a 是否在膀胱癌中構(gòu)成調(diào)控環(huán)路，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。對E2F3與mir－17－92基因簇之間的調(diào)控環(huán)路的研究可能為膀胱癌發(fā)病機(jī)制研究和膀胱癌生物治療帶來重大突破，同時可為膀胱腫瘤提供一個全新的腫瘤標(biāo)記物，對膀胱癌的診斷和預(yù)測將有重要臨床價值。

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