2種鹽酸特比萘芬乳膏體外透皮擴散試驗研究Δ

鄧 紅，張 蜀，林華慶，張肖玲，卜 水，李欣蔚（廣東藥學院藥物研究所/廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣州市 510006）

鹽酸特比萘芬（Terbinafine hydrochloride）是一種新型的丙烯胺類抗真菌藥，是真菌角鯊烯環氧化酶特異性抑制劑，用于治療淺表皮膚真菌病，可經皮膚給藥以達局部治療目的。本試驗采用小型豬離體皮膚及改良Franz擴散池，考察供試藥鹽酸特比萘芬乳膏的皮膚透過率以及皮膚局部貯藥量，并與上市產品鹽酸特比萘芬乳膏（商品名:蘭美抒?）進行比較，旨在闡明制劑的起效途徑，預測供試藥與已上市產品的一致性。

1 儀器與材料

TK-12B型透皮擴散試驗儀（上海鍇凱科技貿易有限公司）；U3000高效液相色譜（HPLC）儀、二極管陣列檢測器（美國Dionex公司）；KQ-100TDB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；LXJ-IIB型多管離心機（上海安亭科學儀器廠）。

供試藥鹽酸特比萘芬乳膏（批號:090501，規格:0.1 g∶10 g）、空白基質（批號:100501）均由桂林華信制藥有限公司提供；對照藥1%鹽酸特比萘芬乳膏（商品名蘭美抒?，中美天津史克制藥有限公司，批號:09110223）；鹽酸特比萘芬原料藥（濟南明鑫制藥有限公司，批號:081108122，含量:99.7%）；鹽酸特比萘芬標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號:100563-200301，供含量測定用）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑為分析純。

西藏小型豬，♀♂各1只，體重35～40 kg，南方醫科大學實驗動物中心，實驗動物許可證號:SCXK（粵）2006-0015。

2 方法與結果

2.1 透皮擴散試驗方法的建立

2.1.1 透皮擴散試驗一般條件。采用立式改良Franz擴散池（18 mL）及豬腹部離體皮膚。離體皮膚固定于樣品池與接受池之間，角質層面向樣品池，均勻涂抹乳膏，皮膚背面與接受液緊密接觸（不得有氣泡）。有效擴散面積約3.3 cm2，接受系統置于（37±0.5）℃的恒溫水浴中，電磁攪拌，轉速為180 r·min－1。分別于1、3、6、12、24 h取接受液2 mL，并補充相同體積的接受液，24 h后終止試驗。

2.1.2 豬離體皮膚的處理。取豬放血處死，經觀察皮膚無紅腫、充血、破損現象。用電動剃須刀除去腹部毛，取下已去毛的腹部豬皮，小心除去皮下脂肪，洗凈，切割成小塊皮膚，立即進行透皮試驗，其余離體皮膚浸泡于生理鹽水中，置于－4℃冰箱中備用。

2.1.3 接受液的選擇。接受液應具有接受透皮藥物的能力，并盡可能符合類似體內的漏槽條件，常用的接受液有生理鹽水和等滲的磷酸鹽緩沖液等[1]。鹽酸特比萘芬易溶于無水乙醇或甲醇，微溶或極微溶于水[2]，根據藥物的性質和接受液盡可能接近體內環境的原則，制備了系列溶液進行溶解度試驗，結果鹽酸特比萘芬原料藥在各溶液中的溶解度由大到小依次為:3%甲醇溶液＞水≈含0.2%聚山梨酯-80的生理鹽水＞生理鹽水（0.9%氯化鈉溶液）＞pH7.4磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鉀1.36 g，加0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液79 mL，用水稀釋至200 mL，即得）。參考文獻[3，4]，在皮膚擴散面積為3.3 cm2時，體外透皮試驗用乳膏量通常為0.2～1 g，當乳膏用量為1 g時，若藥物的皮膚透過率分別為100%、50%和10%，則接受液中的藥物濃度分別為0.56、0.28 、0.056 mg·mL－1，據此考察鹽酸特比萘芬原料藥在3%甲醇溶液、水與生理鹽水中能否達到漏槽條件，結果見表1。

表1 漏槽條件試驗結果Tab 1 Results of sink condition test

可見，藥物在上述3種溶劑中能否達到漏槽條件要視乳膏中藥物的皮膚透過率而定。因此，結合藥物的性質及人體體液的實際情況，初步選定3%甲醇溶液、水與生理鹽水為接受液。

2.1.4 透皮擴散試驗的條件確定。分別取0.2、0.5、1.0 g供試藥，均勻涂抹于豬離體皮膚上，分別以上述3種溶液為接受液，每種乳膏用量用每種接受液各做1份，按“2.1.1”項下方法試驗，過濾，濾液注入液相色譜儀測定，結果3種不同用量供試品在3種接受液中均未檢出鹽酸特比萘芬。因此，在樣品池能承載的前提下，選定試驗用乳膏量為1.0 g；由于預試驗結果乳膏中藥物幾乎不透過皮膚（即皮膚透過率＜10%），生理鹽水完全可達到漏槽條件，因此，接受液選定生理鹽水。

2.2 含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件。色譜柱:Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相:乙腈-甲醇-pH7.5緩沖液（50∶40∶10）（其中緩沖液的制備方法為:取2.0 mL三乙胺，加水至1000 mL，稀醋酸調節pH至7.5）；流速:1 mL·min－1；檢測波長:224 nm；柱溫:室溫；進樣量:20μL。在此條件下，鹽酸特比萘芬的保留時間約為10 min，理論板數不低于10000。

2.2.2 溶液的制備。精密稱取鹽酸特比萘芬標準品0.01146 g，置于200 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為標準品貯備液。精密量取上述溶液1 mL置于10 mL容量瓶中，加生理鹽水稀釋至刻度，作為標準品溶液（5.73 μg·mL－1，約相當于乳膏透過1%的濃度）。

由于透皮擴散預試驗中，各種條件在接受液中均未檢出鹽酸特比萘芬，因此，取上述標準品貯備液1 mL置于10 mL容量瓶中，加空白基質透過皮膚所得的生理鹽水空白滲透液稀釋至刻度，濾過，作為供試品溶液a；另取做完擴散試驗的整塊皮膚，刮去表面殘留藥膏，用生理鹽水沖洗，稍晾干，剪去多余皮膚，將與軟膏接觸的面積約為3.3 cm2的皮膚剪碎研磨至乳糜狀，移至具塞錐形瓶中，加入20 mL無水乙醇，超聲提取40 min，5000 r·min－1離心，傾取上清液，濾過，揮干，用甲醇溶解，移至5 mL容量瓶并稀釋至刻度，即得供試品溶液b。

取空白基質1 g，按“2.1.1”項下方法試驗，24 h后取出空白基質透過皮膚所得的全部接受液，作為陰性對照溶液a；取下皮膚，按上述供試品溶液b的制備方法制備，得皮膚貯留的陰性對照溶液b。

2.2.3 專屬性試驗。分別取上述標準品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液注入液相色譜儀，記錄色譜。結果，在同一色譜條件下，接受液的陰性對照溶液a和皮膚貯留的陰性對照溶液b均對測定無干擾，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.陰性對照溶液a；2.標準品；3.供試品溶液a；4.陰性對照溶液b；5.標準品；6.供試品溶液b；①.鹽酸特比萘芬Fig 1 HPLC chromatograms1.negative control a；2.standard substance；3.test sample a；4.negative control b；5.standard substance；6.test sample b；①.terbinafine hydrochloride

2.2.4 線性及范圍。分別精密吸取標準品溶液1、5、10、20、30、40、50μL進樣，按上述色譜條件測定，將所得峰面積（A）與實際進樣量（X，μg）進行線性回歸，得線性方程為A＝222.19X+0.2442（r＝0.9999），表明鹽酸特比萘芬進樣量線性范圍為0.00573～0.2865 μg。

2.2.5 回收率試驗。（1）皮膚透過量的回收率試驗:經透皮擴散預試驗，接受液中未檢出鹽酸特比萘芬，因此回收率試驗選擇了相當于透過0.3%、0.7%、1%3種較低的濃度進行。取空白基質各1 g共6份，均勻涂抹于離體皮膚上，以生理鹽水為接受液，按“2.1.1”項下方法試驗，24 h后取出全部接受液，作為空白滲透溶液；取下試驗后的皮膚，刮去表面殘留空白基質，用生理鹽水洗凈，備用。精密量取“2.2.2”項下標準品貯備液0.3、0.7、1 mL各3份，分別置于10 mL容量瓶內，加空白滲透溶液稀釋至刻度；濾過，取濾液，依法測定，記錄色譜，代入線性方程，計算得平均回收率為93.43%，RSD為6.92%。（2）皮膚貯留量的回收率試驗:取上述空白試驗后的皮膚（6塊），剪去多余皮膚，將與空白基質接觸的面積約為3.3 cm2的皮膚剪碎并研磨至乳糜狀，平均分成6份，分別置于具塞錐形瓶中，分別精密加入“2.2.2”項下標準品貯備液1 mL，再加無水乙醇20 mL，超聲提取40 min，5000 r·min－1離心，傾取上清液，濾過，揮干，用甲醇溶解，移至5 mL容量瓶并稀釋至刻度，濾過；取濾液，依法測定，記錄色譜，計算得平均回收率為91.68%，RSD為5.76%。

2.2.6 最低定量限及最低檢測限。精密量取供試品溶液a 1 mL（2份），分別置于50、20 mL容量瓶中，加生理鹽水稀釋至刻度，制成濃度分別為0.1146、0.2865 μg·mL－1的溶液，進樣，以信噪比為3時作為最低檢測限，信噪比為10時作為最低定量限，結果得鹽酸特比萘芬的最低檢測限為0.078 μg·mL－1（相當于皮膚透過率0.01%），最低定量限為0.29 μg·mL－1（相當于皮膚透過率0.05%）。

2.2.7 儀器精密度試驗。取回收率試驗中皮膚透過量供試品溶液和皮膚貯留量供試品溶液，分別連續進樣6次，記錄峰面積，計算RSD值分別為1.2%、1.7%，表明精密度良好。2.2.8 穩定性試驗。取回收率試驗中皮膚透過量供試品溶液和皮膚貯留量供試品溶液，分別在于0、1、4、9、12、24 h各測定1次，記錄峰面積，計算其RSD值。結果溶液在9 h內較穩定（RSD分別為2.6%、2.2%），在24 h時峰面積均略呈下降趨勢，因此，取樣后應盡快測定。

2.3 透皮擴散試驗結果

取供試藥和對照藥依法進行透皮擴散試驗，分別于1、3、6、12、24 h取接受液2 mL（并即時補充同溫度同體積的生理鹽水），過濾，濾液注入液相色譜儀，測定藥物的皮膚透過率（累積透過率（%）＝（）（/W樣×標示量×106）×100%。其中，cn為第n個取樣點的藥物濃度（μg·mL－1）；ci為第（ii≤n－1）個取樣點的藥物濃度（μg·mL－1）；W樣為取樣量（g）；標示量為10 g∶0.1 g。24 h終止試驗后，立即取出皮膚，按“2.2.2”項下供試品溶液b的制備方法制備供試品溶液，依法測定藥物皮膚的貯留量，結果見表2。

表2 透皮擴散試驗結果（n＝6）Tab 2 Results of transdermal diffusion test（n＝6）

可見，2種樣品中鹽酸特比萘芬幾乎不透過皮膚，皮膚局部貯藥量相近。

3 討論

由于人皮膚很難獲得，根據文獻[5]小型豬的皮膚與人的皮膚較為接近，因此選用小型豬腹部皮膚作為體外透皮吸收對比試驗的離體皮膚。

[2，6]比較了不同的色譜條件，最終確定了本試驗所采用的色譜條件；鹽酸特比萘芬在大約224、280 nm波長處有最大吸收，其中224 nm波長處的響應值較大，而本品的皮膚透過率和皮膚貯藥量低，為提高檢測靈敏度，選定224 nm為測定波長；檢測方法中的回收率值結果偏低、RSD值偏大，分析原因可能是檢測的濃度較低及皮膚細胞的某些脂質成分可能對藥液略有干擾所致。

鹽酸特比萘芬乳膏是經皮膚給藥以達局部治療目的，不主張透過皮膚起全身治療作用。本試驗采用小型豬離體皮膚及改良Franz擴散池，考察藥物的皮膚透過率，以及皮膚局部的載藥情況，結果2種樣品中鹽酸特比萘芬幾乎不透過皮膚，皮膚局部貯藥量相近，說明鹽酸特比萘芬乳膏發揮的是局部治療作用，預測2種制劑的藥效和安全性基本一致。

參考文獻

[1]梁 穎，楊新建.4種透皮吸收促進劑對鹽酸苯海拉明透皮性能的影響[J].中國藥房，2008，19（31）:2414.

[2]British Pharmacopoeia Commission.Terbinafine hydrochloride[DB/OL].www.drugfuture.com/Pharmacopoeia/BP 2009/download.aspx?filename=Terbinafine-Hydrochloride-5893.2010-08-03.

[3]李冬梅，路緒文，蘇 芳，等.阿西美辛脂質體凝膠劑的體外透皮擴散研究[J].中國醫院藥學雜志，2003，23（6）:330.

[4]陳 鷹，湯 韌，劉 輝，等.阿昔洛韋棕櫚酸酯脂質體凝膠劑的局部透皮試驗[J].中國醫院藥學雜志，2000，20（6）:324.

[5]謝松梅，楊志敏，呂 東，等.新法規下皮膚外用藥物臨床試驗要求的相關考慮[EB/OL].www.cde.org.cn/dzkw.do?method=largePage&id=311532.2009-12-02.2010-06-23.

[6]余仕汝，高邵陽，朱紅玲，等.鹽酸特比萘芬乳膏含量測定方法的改進研究[J].藥物分析雜志，2008，28（4）:656.