槐杞黃對哮喘大鼠BALF中IL-5及INF-γ的影響

張琴珍，尚云曉

支氣管哮喘是以氣道高反應性和嗜酸性粒細胞性氣道炎癥為特征的免疫紊亂性疾病。眾多研究表明，Th1/Th2功能失衡、Th2細胞優勢分化是導致哮喘發病的重要機制之一［1］。IL-5是由Th2細胞分泌的細胞因子，它促進嗜酸性粒細胞的產生和在氣道的聚集。Th1細胞分泌INF-γ等細胞因子，抑制哮喘反應。目前，支氣管哮喘的治療主要依靠抗炎和解痙，而針對免疫發病機制的治療較為薄弱。槐杞黃為臨床輔助治療兒童支氣管哮喘的免疫調節藥物，本實驗通過給予哮喘動物模型不同的干預措施，測定Th1、Th2細胞因子水平，比較不同干預效果，以期為兒童哮喘的臨床治療提供理論及實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 卵蛋白(美國Sigma公司)，百日咳滅活菌苗(北京生物制品研究所)，醋酸地塞米松片(天津藥業有限公司)，槐杞黃(啟東蓋天力藥業有限公司)，ELISA試劑盒(美國GBD公司)。

1.2 實驗動物 雌性Wistar大鼠40只，SPF級，體質量(140±10)g，由中國醫科大學中心實驗室動物部提供，飼養條件一致。

1.3 分組和模型制備

1.3.1 動物分組 隨機分成4組:正常對照組(N)、哮喘模型組(A)、地塞米松組(DXM)、地塞米松組+槐杞黃組(H)，每組10只。按不同的影響因素分別進行研究。飼養期間給予正常飲食。

1.3.2 大鼠哮喘模型的制作［2］除N組外，于第1、7天，各組大鼠腹腔注射1%卵蛋白1 mg、1%氫氧化鋁凝膠及6×109/mL百日咳滅活菌苗致敏液共1 mL，共致敏2次。第15天開始霧化吸入2%卵蛋白誘喘。每日30 min，連續7 d。N組大鼠以生理鹽水代替激發液進行處理。

1.3.3 給藥 自第15天起連續7 d，激發前30 min，各組灌胃給藥(均配成3 mL)。N組:生理鹽水3 mL;A組:生理鹽水3 mL;D組:地塞米松1 mg/kg，3 mL;H組:地塞米松1 mg/kg+槐杞黃8 g/kg，3 mL。

1.4 取材 于末次激發后24 h內取材。以10%水合氯醛0.4 mL/100 g麻醉后，固定于解剖板，75%酒精消毒，打開胸腔和頸部。心尖取血，靜置2 h，3 000 r/min 4℃離心10 min，取上清 －80℃保存待測細胞因子。支氣管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒細胞(Eos)計數:①止血鉗夾閉氣管上端和右肺主支氣管;②灌洗支氣管和左側肺:用密閉式靜脈留置針插入氣管上端，0.5 mL PBS反復沖洗，共4次，共回收到1.7 mL以上灌洗液，回收率超過85%;③灌洗液4℃、1 500 r/min離心10 min;④回收上清，－80℃保存待檢細胞因子;⑤用1 mL含有1%BSA的PBS重懸細胞沉淀，取10 μL重懸液進行細胞計數。余液再次4℃離心，參數同上;⑥離心后去上清，滴入1滴血清，輕吹散細胞，涂片3張;⑦涂片瑞氏-吉姆薩染色，細胞分類計數，于光學顯微鏡下進行細胞分類，至少數300個細胞每視野，至少進行4個視野的細胞計數。算出嗜酸細胞的百分比，用細胞總數乘以百分比，即得出嗜酸細胞的絕對值。

1.5 ELISA檢測各組大鼠血清OVA特異性IgE、BALF中 IL-5、INF-γ 嚴格按照試劑盒(美國GBD公司)要求操作，試劑盒的檢測最低限為1 ng/mL。IL-5、INF-γ操作步驟按試劑盒要求進行。擬合標準曲線，得到直線方程后，根據各樣品孔OD值推算出樣品中IL-5、INF-γ含量(pg/mL)。

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件行統計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，ANOVE Tukey檢驗比較各組間差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況觀察 經OVA激發后，模型組小鼠出現煩躁不安、呼吸增快、咳嗽、腹肌收縮、弓背向上、抓撓口鼻、反應遲鈍、二便失禁等癥狀，嚴重者可見呼吸急促，呼吸節律不整，口唇紫紺;長期激發可見體質量減輕，毛色失去光澤，精神狀態差。給藥組和陽性對照組上述癥狀可獲得不同程度的緩解。

2.2 對血清各項指標的影響 對血清中OVAIgE、BALF中IL-5含量和細胞總數(×106/mL)及Eos%的影響:上述各指標A組較N組顯著增高(P＜0.05);D組和H組較哮喘模型組有所改善(P＜0.05);H組較D組進一步下降(P＜0.05);與N組相比，H組OVA-IgE、IL-5含量和Eos%基本降至正常水平，差異無統計學意義(P＞0.05)。BALF中 INF-γ的水平:A組低于 N組(P＜0.05);D組和H組各指標較A組回升(P＜0.05);H組較D組進一步回升(P＜0.05)，與N組比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 不同干預對血清各項指標的影響(±s)

表1 不同干預對血清各項指標的影響(±s)

注:與正常組比較，*P＜0.05;與哮喘組比較，#P＜0.05

組別 只 OVA-IgE IL-5 INF-γ 細胞總數 Eos(%)P N 10 172.29±2.98 22.87±6.26 80.19±8.82 1.17±0.34 0.89±0.49 ＜0.05#10 436.40±2.77 54.94±10.32 55.83±10.08 2.91±0.62 20.85±17.49 ＜0.05*D 10 268.56±4.83 43.63±7.96 63.10±5.75 2.07±0.63 11.55±7.73 ＜0.05*#H 10 179.22±3.98 27.61±5.24 74.43±7.60 1.52±0.53 2.52±4.40 ＜0.05#*A

3 討論

大量研究表明，支氣管哮喘的發病過程中存在Th2細胞的過度分化和Th2細胞因子的過度分泌，是氣道炎癥啟動和維持的關鍵因素。在哮喘的發病機制中，細胞因子不僅在慢性氣道炎癥中起著重要作用，在很大程度上還決定著Th細胞的分化趨勢。有研究表明，Th類型的主要依據為Th0在受到外界抗原刺激后，主要分泌哪類細胞因子，而調控和決定細胞因子產生的關鍵取決于哪類轉錄因子占主導，STAT4/STAT6、T-bet/GATA-3兩組轉錄因子在Th0分化中起關鍵作用［3］。IL-5的異常分泌與轉錄因子 Sp1、E12/E47、Oct-2、c/EBPbeta、GATA-3和酪氨酸激酶JAK2、JAK1等表達異常有關［4-5］。Th2細胞主要分泌包括 IL-5在內的一系列細胞因子。IL-5是Eos的存活發育因子，可刺激骨髓Eos增生，并促使Eos從骨髓到外周血再向氣道募集，是較強的Eos增殖和趨化因子。IL-5還可促使Eos活化，并誘導Eos釋放陽離子蛋白等毒性蛋白顆粒，產生過氧化物陰離子等增多。另外，IL-5還可以通過抑制Eos凋亡而增強其存活力，從而導致哮喘的嗜酸性粒細胞性氣道炎癥［6］。Th1細胞主要分泌包括INF-γ在內的一系列細胞因子。INF-γ在支氣管哮喘中起保護作用，其分泌減少與哮喘的發生關系密切［7］。眾多研究表明，糾正Th1/Th2功能失衡，可以減輕支氣管哮喘的癥狀［8］。槐杞黃由中藥槐耳、枸杞和黃精等成分組成。體外研究表明，中藥槐耳可通過多種途徑對T淋巴細胞紊亂進行調節［9］。筆者通過比較干預前后各種細胞因子水平，證實哮喘大鼠模型存在嗜酸性粒細胞大量聚集的氣道炎癥、Th2優勢分化和Th2細胞因子過度分泌的Th1/Th2功能失衡。通過地塞米松的治療，上述情況可以得到一定程度的緩解，而加用槐杞黃則可使上述情況基本恢復至正常水平。本實驗僅初步驗證了槐杞黃可調節Th1/Th2功能失衡，其具體機制尚待進一步的研究。

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