氟西汀對大鼠肺動脈平滑肌細胞體外增殖的影響

朱少平，趙金平，毛志福，黃 杰，王君鈺，周雪峰，徐 明

肺動脈平滑肌細胞(PASMCs)異常增殖是肺動脈高壓(PAH)的常見病理特征，其直接后果是導致肺動脈分支狹窄甚至閉塞，肺循環阻力增高［1］。PAH患者和動物模型中5-羥色胺(Serotonin，5-hydroxytryptamine，5-HT)異常增高，是觸發PAH的重要因素之一，其在PAH的病理發生和演變過程中擔當著不可忽視的角色。5-HT是一種肺血管收縮劑和促有絲分裂劑，其促有絲分裂效應的實現主要依賴于一種與其具有高親和力的5-HT轉運體(5-HT transporter，5-HTT)。有研究表明，5-HTT抑制劑能逆轉野百合堿誘導的大鼠PAH［2］，提示5-HTT的活性與PAH動物模型中肺血管重構密切相關。本研究擬通過觀察5-HTT抑制劑氟西汀對離體PASMC體外增殖的影響，以期為5-HTT抑制劑治療PAH提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 Wistar大鼠(二級雄性，7周齡，湖北省實驗動物中心提供)。氟西汀(Fluoxetine，Sigma，美國)，野百合堿(MCT，Sigma)，小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，胰蛋白酶(Sigma)。酶標儀(BIO-TEK，美國)，流式細胞儀(貝克曼庫爾特，美國)，高速離心機(金壇市醫療儀器廠，中國)，凝膠成像分析系統(UVP，美國)

1.2 方法

1.2.1 大鼠PASMCs制備與分組 大鼠PASMC原代分離、培養方法采用組織塊貼壁法［3］，50 mL培養瓶常規細胞培養PASMC至亞融合狀態，0.5 mL 0.25%的胰蛋白酶消化，顯微鏡下觀察細胞部分脫壁時，即加含有10%小牛血清的培養基終止消化，吹打制成單細胞懸液，以血細胞計數板計數細胞，調整PASMC懸液濃度為1×104/mL，以每孔100 μL接種于96孔培養板，待細胞貼壁生長后，棄原培養液，PBS洗2次后分組(見表1)。

表1 實驗分組設計

5-HT+Flu組另分為5 個亞組:A、B、C、D、E，各亞組中分別加入 Flu終濃度為 5、10、20、40、80 μg/mL的培養液100μL，每組設6個復孔，連續培養24、48、72 h，根據細胞生長情況，每24 ～48 h 左右換培養液1次。

1.2.2 抗平滑肌肌動蛋白α-actin免疫細胞化學染色 將平滑肌細胞制成細胞爬片后，冷丙酮固定10 min，PBS沖洗3遍，后續操作依照鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶連接法(S-P法)試劑盒進行。

1.2.3 MTT比色法細胞數目測定 在96孔平底細胞培養板接種濃度約為1×104/mL的PASMC，100 μL/孔，用含10%胎牛血清的DMEM補到200 μL，在常規條件下培養24 h(37℃，5%CO2)后，換無血清的DMEM培養基，同步化24 h后，分別于 24、48、72 h 每孔加入20 μL MTT 溶液;將培養板移入37℃、5%CO2及飽和濕度的溫箱內靜置5 h，棄培養液，然后每孔加100 μL預先配制的DMSO溶液，微振蕩器上振蕩10 min混勻，繼續培養3 h，使MTT結晶完全溶解，用酶標儀測定490 nm波長處各孔的吸光度值A490，取各復孔A490值的平均值作為統計數據。

1.2.4 流式細胞儀檢測(FCM) 選擇第4～6代生長良好的大鼠PASMC，按1×104/mL的濃度接種入6孔平底塑料培養板，將培養液換為無血清的DMEM培養24 h(37℃，5%CO2)，使細胞同步化后，分別于 48、72 h消化收集各組細胞，1 000 r/min離心5 min，PBS漂洗，過濾，調整單細胞懸液濃度為1×106/mL;1 000 r/min離心5 min，PBS漂洗，200目濾網過濾，調整單細胞懸液濃度為1×106/mL，離心，棄上清液;PBS漂洗2次，每管加入70%預冷乙醇1.5 mL固定，并用Tip頭輕輕混勻，－20℃固定過夜后離心棄乙醇，用PBS洗滌2次;留取細胞懸液 50 μL，加入終濃度為1 mg/mL的 RNase 100 μL，于37 ℃水浴30 min，立即置于冰水浴中;加入終濃度為500 μg/mL的PI染液50 μL，避光染色30 min，4 h內轉入 FCM 測量管上流式細胞儀檢測。

1.2.5 統計分析 采用SPSS 13.0統計分析軟件進行統計分析，組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 顯微鏡下觀察 在倒置光學顯微鏡下，大鼠PASMC呈梭型，細胞中心有深染的卵圓形細胞核(見圖1)，細胞生長呈現出分布不均勻的“峰－谷”樣特征。免疫組化S-P法做α-actin抗體免疫組化染色，可見細胞胞漿中呈現棕色深染顆粒(見圖2)。

圖1 傳代培養的PASMC，呈現典型“峰-谷”特征(箭頭)(HE×100)

圖2 PASMC α-actin陽性表達(箭頭)(SP×400)

2.2 各組PASMC細胞周期分析結果比較 FCM細胞周期分析結果表明，各組細胞培養48 h后，5-HT組細胞S期細胞比例［(43.36±1.04)%］較Control組［(24.76±1.02)%］明顯上升，G0/G1期細胞比例［(51.54±1.13)%］較 Control組［(69.35±1.04)%］明顯下降(P＜0.01)。Flu組(Flu濃度為10 μg/mL)48 h后與Control組比較，二者在G0/G1期、S期細胞百分數上差異無統計學意義。48 h后，5-HT+Flu組與5-HT組PASMC細胞周期分布情況比較，G0/G1期細胞比例較Control組明顯上升，而S期細胞比例較Control組明顯下降(P＜0.01)，5-HT+Flu組與Control組對應值比較，差異無統計學意義(P＞0.05)(見表2)。

表2 培養72 h后各組對PASMC細胞周期的影響(n=6)

2.3 不同濃度Flu對PASMC增殖的影響 5-HT組(Flu 0 μg/mL)細胞培養48 h后，A490值較 Control組明顯增加，至72 h時，兩組比較，P＜0.01。PASMC培養24 h后，未觀察到不同Flu濃度組之間A490值差異存在統計學意義。48 h后，Flu濃度為20 μg/mL時，該組 A490值較5-HT組顯著降低(P＜0.05)，且隨著Flu濃度遞增，A490值進一步下降，當Flu濃度為80 μg/mL時，該組A490值與5-HT組對應值比較，P＜0.01，至72 h末，上述變化趨勢更明顯(見表3)。

表3 不同濃度Flu在各時間點對PASMC增殖(A490)的影響

3 討論

5-HT對肺動脈具有強大的促收縮功能，目前研究表明，5-HT在PAH肺血管重構中擔當重要角色，其機制之一為促進平滑肌細胞遷移和增生［4］。PAH患者血液中5-HT水平高于正常，已得到多數實驗結果的證實［5-7］，提示5-HT與人類PAH的病理發生過程密切相關。

本實驗中采用5-HT對體外培養的PASMC細胞進行干預，48 h該組細胞A490值與空白對照組相比顯著升高，而Flu及5-HT+Flu組細胞此時未觀察到這一現象，提示5-HT在體外對PASMC具有明顯的刺激作用。5-HT+Flu組細胞在給予5-HT刺激的同時，分別給予濃度范圍5～80 μg/mL的氟西汀干預，通過比較不同時間和不同Flu濃度的PASMC A490值，隨著濃度的增高或時間的延長，A490較對照組逐漸降低，提示氟西汀對體外5-HT刺激所致的PASMC增殖的抑制作用具有濃度依賴性。細胞周期分析顯示，氟西汀作用于PASMC 72 h后，細胞周期分布表現為S期細胞比例下降，G0/G1期細胞比例上升，提示氟西汀抑制PASMC增殖主要是通過抑制DNA復制實現的。

長期服用食欲抑制劑可以拮抗5-HTT，從而使血漿及下丘腦5-HT水平增加。既往研究表明，該作用與PAH危險性增加有關［8-9］。19世紀30年代，食欲抑制劑延胡索酸的應用使歐洲PAH患病人群明顯增加，隨后，類似藥物如右旋酚氟拉明的應用同樣被證實與PAH發病增加有關［10］。然而，其他藥物如選擇性5-羥色胺重攝取抑制劑雖然增加血漿5-HT水平，但似乎并未增加PAH發病的危險性［11］，提示尚有其他未知因素參與PAH的病理過程。

［1］ Chen H，Taichman DB，Doyle RL.Health-related quality of life and patient-reported outcomes in pulmonary arterial hypertension［J］.Proc Am Thorac Soc，2008，5(5):623-630.

［2］ Guignabert C，Raffestin B，Benferhat R，et al.Serotonin transporter inhibition prevents and reverses monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats［J］.Circulation，2005，111:2812-2819.

［3］ Li J，Li JJ，He JG，et al.Atorvastatin decreases C-reactive protein-induced inflammatory response in pulmonary artery smooth muscle cells by inhibiting nuclear factor-κ B pathway［J］.Cardiovasc Therapeut，2010，28:8-14.

［4］ Tofovic SP，Zhang X，Jackson EK，et al.2-Methoxyestradiol mediates the protective effects of estradiol in monocrotaline-induced pulmonary hypertension［J］.Vasc Pharmacol，2006，45:358-367.

［5］ Van Wolferen SA，Marcus JT，Boonstra A，et al.Prognostic value of right ventricular mass，volume，and function in idiopathic pulmonary arterial hypertension［J］.Eur Heart J，2007，28:1250-1257.

［6］ Humbert M，McLaughlin VV.Proceedings of the 4th World Symposium on Pulmonary Hypertension，February 2008，Dana Point，California，USA［J］.J Am Coll Cardiol，2009，54(Suppl.1):S1-117.

［7］ Diller G-P，Baumgartner H.Pulmonary arterial hypertension inadults with congenital heart disease［J］.Int J Clin pract，2009，64(Suppl.165):13-24.

［8］ Galie N，Manes A，Negro L，et al.A meta-analysis of randomized controlled trials in pulmonary arterial hypertension［J］.Eur Heart J，2009，30:394-403.

［9］ Chan SY，Loscalzo J.Pathogenic mechanisms of pulmonary arterial hypertension［J］.J Mol Cell Cardiol，2008，44:14-30.

［10］ Quarck R，Nawrot T，Meyns B，et al.C-reactive protein:a new predictor of adverse outcome inpulmonary arterial hypertension［J］.J Am Coll Cardiol，2009，53:1211-1218.

［11］ Higenbottam T.Pulmonary hypertension and chronic obstructive pulmonary disease:a case for treatment［J］.Proc Am Thorac Soc，2005，2:12-19.