HPMA在骨靶向藥物輸送方面的應用

劉衍志，崔 燎

(1.廣東天然藥物研究與開發重點實驗室，廣東 湛江 524023;2.廣東醫學院藥理教研室，廣東 湛江 524023)

1 簡介

HPMA(N－2－羥丙基-甲基丙烯酰胺聚合物)是1975年由Kopecek實驗室研究合成出來的多聚物。起初HPMA被設計成血漿增容劑，幾十年后此種水溶性多聚物的應用范圍不斷擴展，從工業應用到大分子藥物，逐漸在高分子治療領域中扮演重要的角色。HPMA最先應用于作為抗癌藥物的載體，取得了顯著的成效，現在至少有5種相關藥物處在不同的臨床試驗階段［1］。隨著對HPMA藥物輸送系統研究的不斷深入，HPMA用于藥物載體的研究逐漸拓展到骨骼疾病與炎癥疾病等領域。

HPMA的創造者Kopecek說，經過詳細研究一系列親水性聚合物的結構和它們的生物相容性的關系后，選擇了N取代的甲基丙烯酰胺做為他們的目標，因為在α－碳取代和N－取代的酰胺鍵能夠保證聚合物側鏈的水解穩定性［2］。把HPMA作為藥物載體的特點如下:

1.1 合成方法簡單 HPMA可以通過共聚作用，同型聚合反應［3］，以及多種單體聚合而合成。聚合物的分子量和多分散性可以通過游離自由基聚合反應控制，比如說ATRP或者是 RAFT 技術［4，5］

1.2 合成出的多聚物具有良好的水溶性和生物相容性 改進疏水性小分子藥物的水溶性，使藥物分子的生物利用度增高，保護不穩定分子使其不容易降解，增加藥物分子在血漿內的循環時間，降低藥物的非特異性毒性以及增加藥物在目標位點的累積［6］。

1.3 聚合物側鏈可通過多種反應添加多種治療分子，靶向分子，以及示蹤分子。HPMA與藥物連接結構是藥物靶向到預定部位釋放的重要的組成部分，根據對藥物機理的研究加上對特定組織或器官具體微環境特點的研究，用不同的連接結構接上各種功能性因子［7～9］。

1.4 從機理上看，對HPMA復合藥物輸送系統研究發現可以改變藥物的內化，細胞內的運輸路徑，增強藥物的作用和靶向性［10］。

2 HPMA應用于骨靶向輸送系統的研究

目前大部分治療骨骼疾病的藥物都沒有針對骨骼的特異性，而且集中于抗骨吸收藥物，在一些促骨形成藥物的研究中，雖然一些藥物有很好的促骨形成效果，但是常常也伴隨著較強的副作用，限制了此類藥物的臨床應用。例如前列腺素1和2以及它們的類似物、PTH等。因此學者們致力于研究靶向骨骼的藥物。骨骼是一種特殊的器官，它與其他軟組織和器官的區別在于含有大量的羥基磷灰石?；诖颂攸c，研究者們致力于尋找與羥基磷灰石具有強烈親和力的分子，目前主要有四環素(TC)，鈣黃綠素，雙磷酸鹽(BPs)，D構型天冬氨酸寡肽(D－Aspx)等。

2.1 HPMA－TC 首先被選為與HPMA相結合的靶向分子是四環素。四環素是一種常見的抗生素，其對骨內羥基磷灰石(HA)有著強烈的親和力，因此極容易沉積于骨骼和牙齒中，在骨骼和牙齒的新生階段尤為常見。在骨形態計量領域常被用來作為骨骼形成的標記物。前期的研究者利用結構簡單的TC結構類似物(ATC)合成HPMA－TC復合物［11］，在最初動物體內試驗表明，此復合物能很好的與體內的羥基磷灰石相結合，但是復合物在單次的大劑量注射后，出現動物死亡。急性的低血鉀癥被懷疑是主要的原因。

2.2 HPMA－ALN 雙磷酸鹽類藥物能夠強力抑制骨的吸收，而且對骨骼內的羥基磷灰石有非常好的親和力。單次注射阿侖膦酸鈉(ALN)，總藥量的50%都分布在骨骼上。進一步發現，在體內ALN能強力附著在各種類型的骨表面，體外ALN對羥基磷灰石的附著實驗證明［12］，其對羥基磷灰石結晶度成熟程度并不敏感，在各種類型的羥基磷灰石均可很好的附著。這些研究使得ALN作為骨靶向的前藥有很好的前景。

在合成HPMA－ALN聚合物的早期，合成的策略是先合成甲基丙烯酸ALN單體，然后再聚合成HPMA－ALN，但這樣的策略無法用常規方法從得到的甲基丙烯酸鹽衍生物中分離出合成產物甲基丙烯酸ALN單體。后來轉為利用同型聚合物反應，仍然存在低反應率，低ALN配合率的問題，產物的分離要求也比較高(需制備型HPLC)［13］。因此合成HPMA－ALN的路線尚需研究優化。FITC標記的HPMAALN在動物體內實驗證明，復合物能夠有效的螯合到骨骼上，特別是螯合在骨高轉換位點［14］。

Satchi－Fainaro的實驗室利用HPMA－ALN復合物的親骨特性，在HPMA上接入強力的血管生成抑制因子TNP－470用于靶向骨腫瘤的治療，取得了很好的效果［15］。通過可逆加成－斷裂鏈轉移聚合(RAFT)將HPMA、ALN以及TNP－470連接形成復合物HPMA－ALN－TNP－470。此復合物帶有一個組織蛋白酶K－清除連接基團，當復合物正確到達骨骼位點后，裂解釋放TNP－470。HPMA－ALN－TNP－470復合物能夠通過抑制內皮細胞和骨肉瘤細胞的分化、遷移以及類毛細血管樣微管形成，減少腫瘤的高血管滲透性，小鼠體內實驗表明，復合物能顯著抑制人骨腫瘤生長達96%。

2.3 HPMA－Aspx 研究證實陰極氨基酸是一些骨相關蛋白的主要構成成分，而發現唾液蛋白能夠強烈的與牙釉質相結合的原因是由于唾液蛋白的一級結構中存在有陰性氨基酸序列。因此，陰性氨基酸序列可被用于發展成為骨靶向藥物的靶向分子。在合成出雌二醇與天冬氨酸六肽(Asp6)的復合物(E2·3D6)實驗中單次注射一天后，骨骼內的雌二醇含量是單用雌二醇的100倍，在骨骼中聚集了有效濃度的雌二醇刺激骨形成，延緩骨丟失，而且E2·3D6的使用不會像單用E2那樣，出現肝臟肥大等副作用［16］。

天冬氨酸寡肽與HA的結合能力只與氨基酸的數目相關，研究者為了得到更好的骨靶向性，選擇了合成用FITC(異硫氰酸熒光素)標記的D構型天冬氨酸八肽與HPMA復合物(HPMA－GG－D －Asp8－FITC)［7］。在體外的羥基磷灰石結合實驗中，復合物能迅速的與羥基磷灰石結合，1 h內，80%的復合物都附著在羥基磷灰石上。健康小鼠靜脈注射劑量0.5 g·kg－1P－GG －D －Asp8－FITC，在24 h后取長骨切片計量學結果顯示，骨干的內膜、外膜以及骨干骺端的骨表面均可見復合物附著，尤其在骨轉換高的區域，比如骨干骺端的松質骨區域［14］。復合物在去卵巢三個月后的大鼠(OVX)體內實驗，依舊使用0.5 g·kg－1劑量的 HPMA －GG－D－Asp8－FITC注射，結果同樣顯示，復合物能夠很好的結合在骨轉換高的位點［17］。

HPMA－D－Asp8與HPMA－ALN骨形態計量學對比研究發現，雖然兩者都很好的結合在骨高轉換位點，但是它們結合的區域并不完全相同，HPMA－ALN在骨轉換中的骨形成和骨吸收區域都有分布，而HPMA－D－Asp8更傾向于分布在骨吸收表面。在一項ALN與Asp8體外對羥基磷灰石結合度的對比實驗證實了兩者的區別，首先ALN與牙釉質的平均親和力有190 N，而Asp8的親和力只有100 N。其次ALN與Asp8分別與兩種結晶度不同的羥基磷灰石進行粘合實驗，結果ALN與不同結晶度的羥基磷灰石粘合百分率相同，而Asp8粘合百分率顯著傾向于成熟的，結晶度高的羥基磷灰石(例如骨吸收表面)［12］。

至此，總結一下可以得出，TC，D－Asp8，ALN三種靶向分子的特性，TC青睞骨形成表面，D－Asp8青睞骨吸收表面，而ALN則可以等同分布于兩種表面。

這些研究結果使得研究者今后在研究骨靶向藥物的時候，能夠不僅僅是將藥物靶向到骨骼，而是可以通過選擇不同的靶向分子使藥物能夠更進一步的靶向到骨的不同表面，從而發揮更為準確的作用。

2.4 HPMA－PGE1PGE1是強力的促骨生成因子，當給予促骨合成劑量范圍的藥物時，PGE1能夠激活相應骨細胞表面上的的EP受體達到促骨合成的作用。它被選為第一個與HPMA聚合物靶向骨骼疏松系統相結合的治療因子，利用之前介紹過的對骨骼有很好靶向性的P－Asp8與PGE1相結合，形成一個靶向骨骼的藥物輸送系統(HPMA－D－Asp8－PGE1)。此復合物包含了雙靶向的設計(D－Asp8和組織蛋白酶K特異性裂解片段)。首先D－Asp8將藥物系統靶向骨骼，當復合物粘附骨骼，由于破骨細胞特異性表達組織蛋白酶K，尤其傾向于粘附在骨吸收表面，特異性裂解片段裂解，釋放PGE1。這樣的輸送系統首先能大大減少PGE1的副反應;其次使PGE1能在最需要新骨形成的區域(骨吸收表面)刺激新骨形成，保持甚至改善骨質量;再次P－Asp8－PGE1復合物能夠避免PGE1在到達釋放位點之前，各種可能的消除機制對PGE1的破壞，延長PGE1在體內的半衰期，最后復合物輸送系統能在完成輸送任務后再從骨骼中裂解清除，通過腎小球濾過排出體外［2］。

HPMA－D－Asp8－PGE1復合物進行了體外細胞評價實驗，復合物分別引入到破骨細胞，成骨細胞，在它們的前體細胞以及非骨骼細胞中，觀察復合物對細胞的影響及其進入細胞的途徑。共聚焦熒光顯微鏡的結果顯示，細胞均通過內吞作用將復合物“吃”入細胞，并聚集于溶酶體/內體區域，然后裂解釋放PGE1。在人源的細胞培養實驗中，PEG1的釋放順序為破骨細胞(FLG－OC)＞成骨細胞(Saos－2－OB)成骨前體細胞(Saos－2)，破骨前體細胞(FLG29.1)，以及控制組細胞(HS－5)。在鼠源的細胞培養實驗中與人源的基本一致，但有細微差別。此實驗證實HPMA－D－Asp8－PGE1復合物能順利的進入破骨/成骨細胞內，通過結構中的組織蛋白酶K裂解片段的裂解釋放PEG1，間接證實了藥物輸送系統將在骨骼高轉換區域富集并發揮作用。另外實驗還發現組織蛋白酶L和酯酶也是對PEG1的釋放發揮作用的酶［18］。

HPMA－D－Asp8－PGE1復合物在老年去卵巢大鼠(OVX)的體內實驗顯示［19］，單次注射28 d后，去卵巢大鼠的骨形成率(BFR)，礦化表面百分率(MS)等骨形成指標與非靶向對照組相比顯著提高，并且HPMA－D－Asp8－PGE1的注射沒有發現常常伴隨著單純PEGs注射出現的顯著的不良反應。更為重要的是，PGE1與HPMA形成靶向藥物輸送系統后，復合物中含有的少量PEG1能夠達到以往使用大量PGE1才能達到的生骨效果。

雖然HPMA－D－Asp8－PGE1靶向輸送系統展示了很好的效果，但還面臨著一些問題。在人、大鼠、小鼠血漿，37℃溫育測定藥物穩定性實驗中。HPMA－D－Asp8－PGE1復合物在人血漿中表現穩定，但在鼠類血漿中卻釋放了大量的PGE1，這可能是復合物結構中PGE1與HPMA相連的酯鍵在血漿中裂解釋放了PGE1，在大鼠血漿中，酯鍵主要由丁酰膽堿酯酶催化裂解，而在小鼠血漿中，酯鍵的裂解不僅由丁酰膽堿酯酶催化，羧酸酯酶也參與了裂解［20］。這樣的種屬特異性使得HPMA－D－Asp8－PGE1靶向藥物的發展陷入了一種尷尬的境地，因為藥物的臨床前評價必須在鼠類模型及其他非鼠類動物模型上評估，所以即使復合物在人血漿中表現穩定，但此在鼠類循環系統內的缺陷，使得HPMA－DAsp8－PGE1必須進一步改良。值得慶幸的是，復合物在老年OVX大鼠上的實驗，并沒有出現嚴重的與設計目的不符的結果。

3 HPMA藥物靶向輸送系統的設計與展望

目前HPMA藥物輸送系統結構的設計主要分為四部分，以HPMA－D－Asp8－PGE1復合物為例。①是HPMA;②是靶向分子;③是治療分子;④是連接靶向分子和藥物分子的連接基團 ，如圖1。

3.1 HPMA分子的設計

3.1.1 HPMA的分子量的大小是藥物輸送系統在體內循環半衰期，消除半衰期，以至輸送系統的被動靶向性的關鍵因素。分子量大的輸送系統能夠獲得更長的半衰期，但其在肝和脾的聚集也響應增多［17］。

3.1.2 HPMA的構型(如圖2)是藥物的合成，藥物的釋放率等方面的關鍵因素，好的構型設計能夠提高藥物在體內的運輸效率，提高藥效，同時在被動靶向性方面也將帶來益處(例如高通透性和滯留效應，EPR)，但是復雜的構型設計將給藥物合成階段帶來困難，而且構型產生的空間位阻也會給藥物的釋放帶來影響。目前按HPMA的側鏈連接的位置不同主要分為:①直線型;②側鏈型;③雙鏈HPMA交聯型;(4)多條或者星形HPMA交聯型。每一種形態的空間結構對于聚合物在體內的清除率都有重要的影響，目前輸送系統設計主要的應用在側鏈型HPMA。

圖1 HPMA－D－Asp8－PGE1復合物的結構

圖2 HPMA多聚物的結構

3.2 藥物分子的連接基團設計 連接基團的設計是HPMA藥物靶向輸送系統中控制靶向/釋放的關鍵結構，寡肽側鏈常被用于作為藥物粘結/釋放的位點。例如HPMA－Dox復合物［8］中出色的針對組織蛋白酶B特異的GFLG肽序列連接結構的設計，在細胞通過內吞作用將大分子物質吸收同化并定位到溶酶體聚集的部位后，GFLG裂解釋放藥物;還有設計pH值敏感的連接結構，基于對炎癥部位的微環境研究，炎癥部位酸性環境可為pH酸性敏感的連接結構提供藥物釋放的場所［9］。在骨靶向藥物 HPMA－D－Asp8－PGE1復合物上，體現為－Gly－Gly－Pro－Nle－寡肽連接和1，6自我消除的4－胺芐醇結構(圖中④和⑤)。那是研究者們參照HPMA－Dox的成功經驗，針對組織蛋白酶K(破骨細胞特異分泌酶)設計的敏感寡肽序列。寡肽片段與PGE1之間用1，6自我消除的4－胺芐醇結構連接，在寡肽片段被組織蛋白酶K降解，胺芐醇發生1，6自我消除，釋放PGE1。在這個設計思路中，胺芐醇與PGE1之間連接的酯鍵(圖1中箭頭)被證實為是該設計的一大缺陷。新的用于替代酯鍵的連接結構和針對骨病理微環境產生的pH變化敏感的連接結構都在發展中。

3.3 靶向分子和治療分子的設計 靶向骨骼的分子目前按結合區域可以分為:①四環素，鈣黃綠素及其衍生物——針對成骨表面;②D構型Asp寡肽(Asp8，Asp6等)——針對破骨表面;③雙磷酸鹽——成骨破骨表面都青睞。

隨著針對骨骼的微環境，細胞亞細胞，分子研究的不斷深入，更多的親骨特性的因子將加入到靶向分子之中。治療分子的選擇今后也將擴展到傳統中醫藥領域的丹參素［21］，蛇床子素［22］，淫羊藿等以及分子醫藥領域抗DKK1蛋白抗體，SOST硬化蛋白抗體等［23，24］。另外以溶酶體為藥物釋放位點的HPMA－藥物復合物經過內吞作用進入細胞，在臨近核區釋放。我們可以得到啟示，在HPMA上接上針對DNA，RNA的調控因子，使得調控因子能夠直接進入核區發揮作用，這將給一些先天性缺陷疾病帶來福音，但這需要對藥物復合物在細胞亞細胞內的運輸路徑和細胞內微環境的更多的基礎研究做鋪墊。

HPMA上不斷重復的結構和N－取代的酰胺鍵，使得一條HPMA側鏈上除了能添加多個靶向因子和治療因子，還能加上各種示蹤分子［25］，如異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)等，展示了可以在一個簡單的結構上實現各種不同的功能。理想的設計是與HPMA接上的不同功能的因子都能夠在合適的階段，合適的部位釋放，發揮自身固有的作用，而各種因子之間不相互干擾。但是多功能的復合物，或多或少都對其它分子產生一些影響(包括復合物分子間和復合物內部的因子之間)。一條HPMA分子上有多個疏水基團，分子內部或分子間的疏水作用力會讓疏水分子在局部空間上的聚集，形成微團結構，這對藥物運輸、釋放率都將產生影響，因此在設計復合物時就應該考慮到引入每一種因子，復合物在體內的環境中所能產生的相互作用力對設計目的的影響。復合物的分子內部和分子間的相互作用，主要由復合物鏈的大小和構型，疏水結構/分子的類型、含量以及在復合物中的位置，復合物的濃度以及其他因素(溫度，溶劑，pH值等)的影響［2］。隨著計算機技術在模擬藥物設計中的運用，結合多種物理檢測技術，將會指導和優化特定復合物的設計。

3.4 展望 經過30多年的發展，HPMA經受了時間的考驗，展示了出色的生物相容性，分子載入的多功能性和完善發展的聚合物合成體系，使HPMA從眾多聚合物載體中脫穎而出，成為研究的熱點。大量的基礎研究和新的HPMA復合物目前集中在癌癥領域，對除癌癥之外的疾病尤其是在骨骼與肌肉疾病方面的研究和新的復合物還很少，可以預見在癌癥之外的疾病領域HPMA將迎來一個新的發展。

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