馬來酸甲基麥角新堿注射液細菌內毒素檢查法建立的方法學研究

李 斌，李俊卿

(1.濱州市食品藥品監督管理局濱城區分局，山東 濱州 256618;2.東營市藥品檢驗所，山東 東營 257091)

馬來酸甲基麥角新堿注射液為子宮收縮藥，臨床用于肌注或靜脈滴注，因此控制其細菌內毒素含量對于藥品的安全性非常關鍵。為了更好地控制藥品質量，筆者參照《中國藥典》2010年版(二部)中“細菌內毒素檢查法”，通過研究，我們建立了本品細菌內毒素檢查法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 ZH－2 BLENDER混勻器;TAL－40型恒溫器(天津藥典儀器廠);無熱原吸頭，微量移液器。

1.2 試藥 細菌內毒素工作標準品(福州新北生化工業有限公司，效價10 EU/支，批號080524);鱟試劑(TAL，靈敏度0.25 EU·mL－1，批號0906242，湛江安度斯生物有限公司);鱟試劑(TAL，靈敏度 0.25 EU·mL－1，批號 08061012，福州新北生化工業有限公司);細菌內毒素檢查用水(批號08060605，福州新北生化工業有限公司 規格:5 mL/支);馬來酸甲基麥角新堿注射液馬來酸甲基麥角新堿注射液(濰坊中獅制藥有限公司;批號:090401、090402、090403;規格:1 mL∶0.2 mg)。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度(λ)復核 按細菌內毒素檢查法，用BET水將細菌內毒素工作標準品稀釋成 2.0、1.0、0.5、0.25 λ 4個濃度進行實驗。結果表明，靈敏度為0.25 EU·mL－1的兩批鱟試劑符合規定，見表1。結果顯示:鱟試劑靈敏度的測定值(λc)在 0.5～2 λ 之間(包括 0.5λ 和 2λ)，可用于細菌內毒素檢查，并以表示靈敏度0.25 EU·mL－1作為鱟試劑的靈敏度。

2.2 馬來酸甲基麥角新堿注射液細菌內毒素限值(L)的確定 藥品的細菌內毒素限值(L)一般按以下公式確定:L=K/M，式中K為按照規定的給藥途徑，人用每千克體重每1 h可接受的內毒素最大劑量，注射劑的K=5 EU·(kg·h)－1;M為人用每千克體重每1 h給藥的最大供試品劑量，經過查閱本品說明書，本品的最大給藥量為0.2 mg，按照我國人均體重 60 kg 計算，M=3.33 μg·(kg·h)－1，因此細菌內毒素理論限值為:L=K/M=5/3.33=1.5 EU·μg－1。

2.3 供試品的最小有效稀釋濃度(MVC) 目前市售的鱟試劑靈敏度(λ)通常在 0.5～0.03 EU·mL－1之間，因此，有效稀釋濃度為 0.002～ 0.333 μg·mL－1之間。選用靈敏度為0.25 EU·mL－1鱟試劑時，供試品的最大有效稀釋濃度C=λ/L=0.25/1.5=0.1667 μg·mL－1。

表1 鱟試劑靈敏度復核

2.4 供試品干擾初篩試驗 用BET水將馬來酸甲基麥角新堿注射液(批號 090401)分別稀釋成原液、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.195 μg·mL－1系列濃度，每一稀釋濃度供試品做2支供試品管和2支供試品陽性對照(即用該濃度的供試品稀釋液將內毒素標準品制成2.0λ濃度的內毒素溶液)，與鱟試劑混合進行抑制/增強試驗，結果表明，供試品在較高濃度時對鱟試劑有干擾作用。在供試品至少稀釋至濃度為12.5 ug·mL－1后則對鱟試劑無干擾作用，見表2。

表2 干擾試驗預實驗結果

2.5 供試品干擾試驗 由干擾初篩試驗可知，選擇靈敏度0.25 EU·mL－1的TAL，用BET水將3批供試品稀釋至濃度為12.5 ug·mL－1后進行干擾試驗。具體操作步驟如下:每個鱟試劑取18支做內毒素水溶液系列反應，即用0.1 mL BET 水復溶，再分別加已制備的 0.5，0.25，0.125，0.06 EU·mL－1內毒素溶液0.1 mL，每一濃度內毒素4支反應管，水溶液陰性對照(NC)2支反應管;另取54支分3組，每組18支做內毒素供試品溶液系列反應，即用0.1 mL BET水復溶，再分別加已制備的含 0.5，0.25，0.125，0.06 EU·mL－1內毒素的濃度為 12.5 μg·mL－1的供試品溶液 0.1 mL，每一濃度內毒素4支反應管，供試品陰性對照(NPC)2支反應管。不同廠家的鱟試劑各做一份，具體結果見表3，Et均在0.5～2.0 Es范圍內，說明供試品稀釋至濃度為12.5 μg·mL－1后確已排除干擾作用，在低于或等于此濃度的情況下即可使用內毒素檢查法。

2.6 供試品細菌內毒素檢查 采用鱟試劑(TAL，靈敏度0.25 EU·mL－1，批號0906242，湛江安度斯生物有限公司)，按照《中國藥典》附錄XI E對供試品(批號:090401090402090403)進行細菌內毒素的檢查，結果3批供試品每μg馬來酸麥角新堿含內毒素的量均小于1.5 EU。

表3 干擾試驗結果

3 討論

3.1 通過實驗表明，本法可用馬來酸甲基麥角新堿注射液細菌內毒素的檢查，檢查時只要將其至少稀釋至濃度為12.5 μg·mL－1，在低于或等于此濃度的情況下，選擇相應靈敏度的鱟試劑即可進行本品的細菌內毒素檢查。

3.2 不同鱟試劑對供試品的反應有差異。本實驗采用兩種不同批號的鱟試劑同時進行干擾試驗，得到了較為滿意結果。