液相色譜法測定飼料添加劑L-肉堿鹽酸鹽

上海市農業科學院農產品質量標準與檢測技術研究所 林 淼 趙志輝

左旋肉堿（L-carnitine）具有提高養殖動物的免疫力、抗應激能力，改善肉品質，提高存活率等作用（周鍵鴻和劉冬生，1996）。它常以鹽酸鹽的形式存在，即L-肉堿鹽酸鹽（左旋肉堿鹽酸鹽）。我國在1999年7月26日，由農業部發布的《允許使用的飼料添加劑品種目錄》中，L-肉堿鹽酸鹽被列入其中。目前國家標準檢測方法是采用非水滴定法。以冰乙酸為溶劑，結晶紫為指示劑，高氯酸為標準溶液滴定L-肉堿鹽酸鹽結構中的堿性氮（飼料添加劑 左旋肉堿 NY/T1028-2006）。此方法的優點是方法簡便，容易操作，成本較低，然而存在的缺點是無法排除其他含有堿性氮結構的物質（如甜菜堿、氯化膽堿等飼料添加劑）干擾。由于L-肉堿鹽酸鹽具有紫外吸收基團，在210 nm處有最大吸收峰，同時在酸性流動相中與庚烷磺酸鈉能夠結合形成疏水性離子對，可經反相色譜分離（趙榕等，2004）。因此本實驗中建立反相液相色譜法測定L-肉堿鹽酸鹽。

1 實驗部分

1.1 方法原理 飼料添加劑中L-肉堿鹽酸鹽用二次蒸餾水超聲提取。在酸性流動相中與試劑庚烷磺酸鈉結合形成疏水性離子對，經反相色譜分離。

1.2 試劑與材料

1.2.1 試劑 甲醇：色譜純；流動相：稱取3.4 g磷酸二氫鉀溶液（0.05 mol/L）及0.20 g庚烷磺酸鈉（0.002 mol/L）溶于500 mL水中，用磷酸調pH=2.5，甲醇（色譜純）含量為5%。

除特殊說明，所用試劑均為分析純。實驗用水為超純水。

1.2.2 L-肉堿鹽酸鹽標準溶液 準確稱取L-肉堿鹽酸鹽標準品（Sigma公司提供）0.0200 g，用二次蒸餾水溶解并定容于10.0 mL，此溶液含L-肉堿鹽酸鹽為2.0 mg/mL。

1.3 儀器與設備 Waters2695高效液相色譜系統：配有2487紫外檢測器；超聲波提取器；溶劑微孔過濾器帶0.22 μm水相濾膜；離心機：10000 r/min。渦旋振蕩器。

1.4 實驗方法

1.4.1 試樣制備 試樣取20 g左右，混合均勻，粉碎，稱取0.1 g（含L-肉堿鹽酸鹽50～100 mg）于100 mL容量瓶中，加入二次蒸餾水約50 mL，超聲提取30 min，用二次蒸餾水定容，混勻，離心，棄初濾液數毫升，收集濾液，過0.22 μm水相濾膜。濾液直接供HPLC分析。

1.4.2 色譜分析 色譜條件：ASB VS851505-0；色譜柱：C8柱，4.6 mm × 150 mm；柱溫：35 ℃；流動相流速：1 mL/min；檢測波長：210 nm；分別取標準溶液及試樣10 μL進樣。根據保留時間及標準加入法定性，試樣峰面積與標準峰面積比較定量。

1.4.3 結果計算 X=Cs×V×W×n/m；W=A/As。

式中，X為試樣中L-肉堿鹽酸鹽含量，mg/g；Cs為標準溶液L-肉堿鹽酸鹽的濃度，mg/mL；V為試樣定容體積，mL；m為試樣重量，g；A為試樣溶液對應的色譜峰面積響應值；As為標準溶液L-肉堿鹽酸鹽對應的色譜峰面積響應值；n為稀釋倍數。

2 結果與討論

2.1 實驗條件優化

2.1.1 色譜柱選擇 由于L-肉堿鹽酸鹽極性較強，普通的C8柱對其保留很弱，即使加入離子對試劑也很難滿足分離要求。于是測試了ASB反相色譜柱，由于其耐水性強（可使用100%水為流動相），并且極性很強，對極性化合物具有很強的分離能力，增強了肉堿的保留能力，可滿足分析要求。

2.1.2 緩沖體系 離子對反相液相色譜要求較嚴格的pH值范圍，對檸檬酸及磷酸鹽緩沖體系分別進行了測試，使用檸檬酸緩沖體系時，靈敏度低且出峰時間過早（2.5 min出峰），不宜與溶劑峰分離（兩種緩沖體系的疊加色譜圖見圖1），所以選擇磷酸二氫鉀-磷酸作為緩沖體系。通過對磷酸二氫鉀濃度以及pH值的選擇，當磷酸二氫鉀濃度為0.05 mol/L、pH值為2.5時，標準品、飼料添加劑L-肉堿鹽酸鹽均可以得到較穩定的分離測定結果。

2.1.3 有機相 分別對乙腈和甲醇進行了測試，使用乙腈出峰時間過早，不易分離。使用甲醇作為有機相時可以得到較好的分離效果。隨著甲醇濃度的不斷加大，L-肉堿鹽酸鹽的保留時間不斷縮短，在5%甲醇的色譜條件下，出峰時間為4 min左右，不受雜質及試劑的干擾，能夠達到實驗的要求。

圖1 兩種緩沖體系的疊加色譜圖

2.1.4 離子對試劑 在1.0、2.0 mmol/L及3.0 mmol/L濃度下，分別對離子對試劑庚烷磺酸鈉的影響進行了實驗。結果表明，隨著庚烷磺酸鈉濃度的加大，肉堿的保留時間增長。但是，離子對試劑對色譜柱損害較大，因此，庚烷磺酸鈉的濃度定為2.0 mmol/L。

因此，在0.05 mol/L磷酸二氫鉀、2.0 mmol/L庚烷磺酸鈉、pH=2.5、5%甲醇的色譜條件下，肉堿出峰時間為4 min左右，不受雜質及試劑的干擾，能夠達到實驗的要求。

2.2 提取條件的選擇 酸性條件有利于L-肉堿鹽酸鹽與庚烷磺酸鈉形成穩定的離子對，因此測試了用0.50 mmol/L鹽酸和純水提取試樣中L-肉堿鹽酸鹽。結果發現，用0.50 mmol/L鹽酸與用純水提取效果均較好，但用鹽酸提取時溶劑峰很高，不利于觀察，而且用純水提取方法簡單，因此本方法選擇純水作為提取液。在上述優化條件下得到了500 μg/g的L-肉堿鹽酸鹽標準譜圖（圖2）。

圖2 標準溶液譜圖

2.3 精密度和準確度實驗 選取3批不同含量的L-肉堿鹽酸鹽飼料添加劑，按照本方法確定的條件進行重復實驗，每批樣品分別制備5份溶液，每個濃度測定3次取平均值，測試L-肉堿含量，得到變異系數分別為0.28%、0.33%和0.25%，結果表明，本方法具有良好的準確度。

2.4 回收率實驗 采用標準加入法對4種飼料添加劑產品進行了回收率實驗（n=3），結果見表1。實驗結果表明，在上述優化條件下本實驗方法可行。

2.5 方法線性范圍及檢出限 配制一系列不同濃度（25～4000 μg/g）的L-肉堿鹽酸鹽標準溶液，在上述優化條件下測得峰面積，以峰面積對濃度作圖，得到了L-肉堿鹽酸鹽的工作曲線。以信噪比（S/N=3）對應濃度確定檢測下限，得到線性回歸方程為y=118.29x-1987.5，相關系數r=0.9999；檢出限為 7.5 μg/g。

表1 回收率結果（n=3）

2.6 抗干擾實驗 甜菜堿和氯化膽堿是兩種與L-肉堿鹽酸鹽類似的含堿性氮結構的飼料添加劑。非水滴定法無法區分這幾類物質。為了確定檢測到的物質不是同類物質，用本方法的色譜條件對這兩種飼料添加劑進行了測試，結果如圖3、4所示。甜菜堿保留時間為2.7 min，而氯化膽堿在此條件下無響應，表明這兩種物質不會對L-肉堿鹽酸鹽造成干擾。

圖3 500 μg/mL甜菜堿標準樣品色譜圖

圖4 500 μg/mL氯化膽堿標準樣品色譜圖

3 實際樣品的測定

用所建立的方法檢測了3家不同廠家飼料添加劑（其中選取典型圖譜見圖5）。由圖5可見，3.5 min所檢測出的色譜峰即為L-肉堿鹽酸鹽。通過與標準品比對，可計算出樣品中L-肉堿鹽酸鹽含量。

4 兩種方法比對

選取不同廠家不同批號的產品，分別按照上述兩種方法（液相色譜法和非水滴定法）確定的試驗條件進行含量的測定，每種樣品測定3次，取平均值，其對比結果見表2。結果表明，兩者無顯著差異。

圖5 飼料添加劑L-肉堿鹽酸鹽譜圖

表2 化學滴定法與液相色譜法檢測L-肉堿鹽酸鹽含量對比檢驗結果（n=3） %

5 結論

本實驗條件下HPLC法測定飼料添加劑L-肉堿鹽酸鹽，方法快速、簡便和靈敏，與傳統非水滴定法結果相同，同時具有抗干擾的優點。為L-肉堿鹽酸鹽的質量控制提供依據。

[1]周鍵鴻，劉冬生.強化L-肉堿對幼鼠生長和脂肪代謝的影響[J].營養學報，1996，18（2）：209 ～213.

[2]趙榕，孫開奇，羅仁才.離子對反相高效液相色譜法測定保健食品中肉堿[J].實驗技術與方法，2004，14（4）：25 ～26.

[3]NY/T1028-2006飼料添加劑 左旋肉堿[S].北京：中國國家標準化管理委員會，2009-5-26.