魚腥草對半滑舌鰨非特異免疫活性的影響

集美大學水產(chǎn)學院 劉金海 鄭志斌 張 偉 譚大明

半滑舌鰨屬鰈形目、舌鰨科、舌鰨屬，俗稱“龍脷”、牛舌頭、鰨目、鰨板、鰙鰨、細鱗、鰨米等，為名貴海水魚類，主要分布于我國的渤海、黃海海域，是一種暖溫性底棲大型魚類，生長速度快，肉味鮮美，經(jīng)濟價值很高（徐永江等，2005；姜言偉和萬景瑞，1998；Engstad 等，1992）。 近年來，魚腥草對小鼠、大鼠及人類的抗菌、免疫研究成果報道較多，但其對魚類非特異免疫能力影響的報道較少。基于魚腥草對小鼠、大鼠及人類具有良好免疫活性及半滑舌鰨病害頻發(fā)的現(xiàn)狀，本文初步開展了魚腥草對半滑舌鰨非特異免疫活性影響的研究，為合理配制半滑舌鰨免疫促生長餌料提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗用魚 半滑舌鰨活魚（93.78±2.97）g

1.1.2 試劑及藥品 魚腥草（購于廈門市集美區(qū)石鼓路大藥房），肝素鈉、KH2PO4、甲醛、NaOH 溶液（0.5 mol/L）（國際集團化學試劑有限公司），Na3PO4（宜興市第二化學試劑廠），姬姆薩染料（上海晶天生物科技有限公司），甘油（福建省廈門向陽醫(yī)藥化工廠），甲醇（上海化學試劑總廠），乙醇（75%）（廣東光華化學廠有限公司），高錳酸鉀（蕪湖市輝隆中信化工有限公司），牛肉膏、蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司），瓊脂、NaCl（廣東省汕頭市西隴化工廠），所用試劑均為AR級。

1.2 儀器與設備 醫(yī)用型凈化工作臺（SW-CJZFD）、生物培養(yǎng)箱（LRH-250-G）、顯微鏡（Leica DF40）、可見分光光度計（V1100）、高壓蒸汽滅菌鍋（YXQ-LS-SII）、離心機（TGL-16C）、電子天平（BS110S）、雙螺桿制粒機（CD4 × 1TS多功能催化劑成形機）、電爐、接種環(huán)、酒精燈、試管、棉塞、培養(yǎng)皿、錐形瓶、量筒、玻璃棒、精密pH試紙、2 mL針管、解剖盤、血球計數(shù)板、計數(shù)器、載玻片、蓋玻片。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗用魚養(yǎng)殖管理 試驗用水族箱（長60 cm、寬40 cm、高40 cm）10個，均具有自動控溫、充氧及水循環(huán)過濾裝置。每箱放15尾半滑舌鰨暫養(yǎng)，每晚18∶00和22∶00各投喂基礎餌料一次。15 d后，測定其免疫指標作為底值。之后投喂免疫餌料，每10 d測免疫指標一次，共測3次。

1.3.2 基礎餌料配方與制備 先將魚粉、沙蠶粉、豆粉、淀粉、礦物鹽、酵母粉和預混料等粉狀成分按所需用量混合均勻，再將攪碎的牡蠣肉、魚油與粉狀料混勻，最后制粒備用。基礎餌料組成見表1。

表1 基礎飼料配方 %

1.3.3 試驗飼料的配制 免疫餌料配方見表2。按照該配方表配制免疫餌料。稱取20、40、60 g魚腥草，分別加適量水熬制濃縮，熬制3次并分別合并濃縮液。將所得3種濃縮液（1#、2#、3#）分別與基礎餌料混勻，制成3種免疫餌料，晾干備用。

表2 試驗餌料配方（每100 g含量）

1.3.4 培養(yǎng)基的配制 使用002營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基配方，參照沈萍等（1999）方法配制。血清溶菌酶活性的測定、吞噬能力的測定、免疫器官（脾臟）指數(shù)測定參照劉金海等（2010）方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 16.0對試驗數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果

2.1 魚腥草對半滑舌鰨溶菌酶活性的影響 對照組溶菌酶活性在 0、10、20、30 d時均無顯著變化（P＞0.05）。試驗開始10 d后，各試驗組溶菌酶活性均顯著高于對照組（基礎餌料組），隨試驗時間延長，各試驗組溶菌酶活性顯著性升高（P＜0.05）。30 d時，試驗組3的溶菌酶活性最高（見表3）。

表3 半滑舌鰨溶菌酶活性

2.2 魚腥草對半滑舌鰨白細胞吞噬活性的影響對照組白細胞吞噬活性（吞噬百分比和吞噬指數(shù)），在 0、10、20、30 d 時變化不大。 試驗開始 10 d后，各試驗組白細胞吞噬活性均高于對照組（基礎餌料組），各試驗組不同時間點上白細胞吞噬活性較對照組均存在顯著性差異（P＜0.05）；除0d外，其余各時間點，隨魚腥草添加劑量增多，試驗組1、2、3 的白細胞吞噬活性依次增強（P ＜ 0.05）。30d時，試驗組3的白細胞吞噬活性最高（見表4、5）。

表4 半滑舌鰨吞噬細胞的吞噬百分比

表5 半滑舌鰨吞噬細胞的吞噬指數(shù)

2.3 魚腥草對半滑舌鰨免疫器官（脾臟）指數(shù)的影響 見表6。試驗組與對照組之間、各試驗組之間脾臟指數(shù)均無顯著性差異（P＞0.05）。

表6 半滑舌鰨脾臟免疫指數(shù)

3 討論

3.1 魚腥草對半滑舌鰨溶菌酶活性的影響 溶菌酶活性是評價魚類免疫力的常用指標之一（黃洪敏等，2005）。溶菌酶是由淋巴細胞分泌的堿性溶解酶，當機體受到病原攻擊時，白細胞聚集在感染區(qū)，包圍異物進行吞噬，此時吞噬細胞活性增強，吞噬細胞中含有溶菌酶，因此隨著吞噬活性的增強也導致了溶菌酶活性的變化（張耀武等，2008）。應惠芳（2006）研究表明，艾葉和鮮魚腥草對金葡球菌、白葡球菌及傷寒桿菌有較強的抗菌作用。袁呂江等（2005）發(fā)現(xiàn)，魚腥草素同系物能夠提高小鼠血清溶菌酶活力，且隨濃度增加增幅加大，最大可達20%。體外試驗時，在低濃度時魚腥草素同系物明顯提高溶菌酶的活性，超過一定濃度時則表現(xiàn)出抑制溶菌酶的活性。本研究發(fā)現(xiàn)，投喂添加魚腥草熬制濃縮液的免疫餌料，可以提高半滑舌鰨溶菌酶活性，在一定劑量內(nèi)，隨試驗時間延長和魚腥草劑量增加而升高。

3.2 魚腥草對半滑舌鰨吞噬活性的影響 眾多的研究表明，魚腥草可以增加試驗動物的特異性或非特異性免疫能力。任翠玉等（1998）用X-射線照射每只口服魚腥草營養(yǎng)液0.4 mL/d的小鼠及對照組1個月后，口服魚腥草營養(yǎng)液的小鼠血清溶血素含量、巨噬細胞吞噬百分率指數(shù)明顯高于對照組。魚腥草注射液可增加中性粒細胞的化學發(fā)光值，而對單核細胞無顯著影響，表明魚腥草注射液可能參與調(diào)整中性粒細胞氧化過程（呼吸爆發(fā)），并增加中性粒細胞的殺菌能力（王潮臨等，1997）。合成魚腥草素可以刺激巨噬細胞呼吸爆發(fā)，提高細胞內(nèi)鈣離子濃度水平，促進T細胞分泌IL-2，說明魚腥草素可能局域激活巨噬細胞和T淋巴細胞的作用（Wang等，2002）。另有研究表明，魚腥草素提高細胞免疫能力可能是由于它靠疏水吸附作用與免疫細胞結(jié)合而發(fā)生作用；魚腥草素同系物在巨噬細胞上吸附后，通過某種途徑對巨噬細胞的酶系發(fā)生激活作用，從而提高了動物的免疫功能。且有試驗表明，延長魚腥草素碳鏈的長度有助于尋找到有高免疫促進作用的新型魚腥草素衍生物（袁呂江等，2004）。本研究發(fā)現(xiàn)，試驗期間投喂添加魚腥草熬制濃縮液的免疫餌料，可明顯提高半滑舌鰨白細胞的吞噬活性，隨試驗時間延長和魚腥草量的增加而增強，這與上述許多研究結(jié)果相一致。

3.3 魚腥草對半滑舌鰨免疫器官（脾臟）指數(shù)的影響 硬骨魚類的脾臟在造血和免疫反應方面都起著重要的作用。脾臟是紅細胞、中性白細胞和粒細胞生成、貯存與成熟的主要器官。其重量變化與機體免疫狀況變化密切相關(guān)（葛立安等，2008）。但喬志剛等（2008）分析認為，魚類的免疫器官重量相對較小，其增加或減少反映到免疫器官指數(shù)上變化不顯著。袁呂江等（2004）研究表明，隨著魚腥草素同系物碳原子數(shù)增加，對受試小鼠免疫器官重量無影響。本免疫試驗設計為30 d，半滑舌鰨免疫器官（脾臟）指數(shù)不隨魚腥草添加劑變化而變化，本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果相一致。

4 結(jié)論

（1）試驗組半滑舌鰨溶菌酶活性和白細胞吞噬活性均高于對照組，且隨試驗時間延長而增高，隨魚腥草添加劑量增多而增強。

（2）魚腥草添加劑量對半滑舌鰨免疫器官（脾臟）指數(shù)影響不顯著（P＞0.05）。

（3）以60 g魚腥草熬制的濃縮液為添加劑制成的試驗餌料，對增強半滑舌鰨非特異免疫活性效果較好。

[1]葛立安，高明輝，徐海濤，等.亞硝酸鹽對異育銀鯽免疫功能的影響[J].飼料工業(yè)，2008，29（10）：27 ～29.

[2]黃洪敏，邵健忠，項黎新.魚類免疫增強劑的研究現(xiàn)狀與進展[J].水產(chǎn)學報，2005，29（4）：552 ～554.

[3]姜言偉，萬景瑞.渤海半滑舌鰨早期形態(tài)及發(fā)育特征研究[J].海洋水產(chǎn)研究，1988，9：193 ～198.

[4]劉金海，王宏志，鐘志曉.殼聚糖等四因素對半滑舌鰨非特異免疫的研究[J].飼料研究，2010，10：7 ～11.

[5]喬志剛，郭向輝，張英英，等.兩種懷藥對黃河鯉幼魚非特異性免疫的影響[J].飼料工業(yè)，2008，29（16）：25 ～27.

[6]任翠玉，周彥鋼，凌文娟，等.魚腥草營養(yǎng)液的研制[J].食品與機械，1998，1：13 ～14.

[7]沈萍，范秀容，李廣武.牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備[M].微生物試驗，1999，50 ～54.

[8]王潮臨.魚腥草等中草藥對外周血中性粒細胞和單核細胞化學發(fā)光影響的研究[J].廣西醫(yī)科大學學報，1997，14（2）：20 ～22.

[9]徐永江，柳學周，馬愛軍，等.半滑舌鰨胚胎發(fā)育及仔魚生長與鹽度的關(guān)系[J].海洋科學，2005，29（11）；39 ～43.

[10]應惠芳.魚腥草等5種中草藥對10種常見細菌體外抑菌實驗研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17（11）：2202 ～2203.

[11]袁呂江，李學剛，何紅梅.魚腥草素同系物對小鼠免疫影響的研究[J].中醫(yī)藥學報，2004，32（5）：25 ～29.

[12]袁呂江，李學剛，何紅梅.魚腥草素同系物在體內(nèi)外對溶菌酶活力的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2005，20（增刊）：268 ～269.

[13]張耀武，郭黛健，陳萬光.殼聚糖對異育銀鯽生長及非特異性免疫功能的影響[J].水利漁業(yè)，2008，28（4）：50 ～51.

[14]Engstad R E，Robertsen B，F(xiàn)rivold E.Yeast glucan induces increase in activity of lysozyme and complement-mediated haemolytic activity in A tlantic salmon blood[J].Fish Shell Immunol，1992，2：287 ～297.

[15]Wang D Y，Yu Q H，Eikstadt P，et al.Studies on adjuvanticity of sodium houttuyfonate and its mechanism [J].International Immunopharmacology，2002，2：1411 ～1418.