高效液相色譜法測定飼料中氯烯雌醚

農業部飼料質量監督檢驗測試中心（成都） 李 云 趙立軍 張 靜

氯烯雌醚為一種非甾體雌激素類藥，能調節垂體前葉釋放促性腺激素，通過減少下丘腦促黃體生成素釋放因子的釋放，降低促卵泡激素（FSH）、促黃體生成激素（LH）從垂體的釋放。氯烯雌醚貯藏于脂肪組織內，并緩慢釋放，較易在動物體內殘留。若食用含有氯烯雌醚殘留的肉食品后會擾亂人體激素平衡。由于氯烯雌醚能夠通過蛋白質同化作用提高食欲、促進畜禽生長，有可能被添加到飼料中用來提高飼料轉化率。

我國已明令禁止在飼料中添加氯烯雌醚，因此有必要制定其定量檢測方法。目前藥物中氯烯雌醚的測定方法有滴定法、高效液相色譜法等，但有關飼料中氯烯雌醚的測定方法鮮見報道。本文建立了飼料中氯烯雌醚的提取、凈化和測定方法。該方法方便實用、準確可靠。

1 材料與儀器

1.1 試劑與材料 除非另有規定，僅使用分析純試劑和符合GB/T6682的三級水，色譜分析用水符合GB/T6682一級水的規定。甲醇：色譜純；乙腈：色譜純；氨水：濃度25%～28%；C18固相萃取柱：200 mg/3 mL；濾膜：0.45 μm，有機相；流動相∶甲醇∶水=82∶18（V∶V）；氯烯雌醚標準品（純度 ＞95%）。

氯烯雌醚標準溶液的配置：（1）標準儲備液：稱取10.0 mg（精確到0.1 mg）的氯烯雌醚標準品，用甲醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，該溶液濃度為100 μg/mL，于4℃冰箱內貯存，有效期1個月。（2）標準工作液：用移液管分別準確移取標準儲備液用甲醇配制標準工作溶液：0.05 μg/mL，1.0 μg/mL，2.0 μg/mL，5.0 μg/mL，10.0 μg/mL，20.0 μg/mL，50.0 μg/mL。現配現用。 淋洗液：25%氨水∶水=5∶95（V∶V）。

1.2 儀器與設備 高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器或紫外檢測器；離心機：5000 r/min以上；渦旋混合器；超聲波清洗器；氮吹儀，可控溫至50℃；固相萃取裝置；高速勻質器；振蕩器；帶蓋塑料離心管：50 mL。

2 方法與結果

2.1 液相色譜條件 色譜柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，粒度5 μm）或性能相當的色譜柱；柱溫30 ℃；流動相流速：1.0 mL/min；檢測波長：307 nm；進樣量：20 μL。

2.2 試樣的提取與凈化

2.2.1 提取 準確稱取配合飼料5 g、濃縮飼料或添加劑預混合飼料稱取2 g（精確到0.01 g），置于50 mL離心管中，加入提取液乙腈10.0 mL，渦旋振蕩2 min。然后將離心管置于振蕩器上振蕩20 min，然后在離心機上以5000 r/min離心5 min，吸取上清液于另一具塞試管中，待凈化。

2.2.2 凈化 每一試樣各準備一只C18小柱，依次用3 mL甲醇、3 mL蒸餾水、3 mL甲醇活化。將上述提取液3.0 mL與等體積的蒸餾水混合均勻后，吸取5.0 mL過此小柱（流速＜1.0 mL/min）。用6 mL淋洗液淋洗,最后用3 mL甲醇洗脫，收集洗脫液于10 mL試管內，洗脫液于50℃下用氮氣吹干，殘余物用1.0 mL甲醇定容，渦旋混合1 min，過0.45 μm濾膜作為試樣制備液，供高效液相色譜測定。

2.3 標準曲線的繪制 在選定的色譜條件下，將分別配制為 0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的標準工作液，將不同濃度的標準工作液分別進樣20 μL做定量校正曲線。以進樣濃度x（μg/mL）為橫坐標，以峰面積y為縱坐標，做標準曲線（結果見表1）。結果表明，氯烯雌醚標準工作液在0.05～50.0 μg/mL濃度范圍內有良好的線性關系。

回歸方程：y=50.596x－8.463（R=0.9996）。

表1 標準曲線繪制

2.4 檢測限和檢出限 在本試驗條件下，將氯烯雌醚標準溶液連續稀釋后加入到空白飼料中經提取測定，根據信噪比（S/N）=3的峰響應值和樣品前處理的稀釋倍數，得出方法的檢測限為0.1 mg/kg。同樣的添加適量標準溶液至空白飼料，經提取測定，依據信噪比（S/N）=10測得方法的定量限為0.3 mg/kg。

2.5 回收率實驗及精密度 為了考查方法及儀器的準確度，對豬飼料﹑禽飼料﹑魚飼料樣品進行了回收率實驗，每個水平平行測定5次，回收率多數大于80.0%；相對偏差小于5.0%，變異系數小于7.0%。結果見表2﹑表3和表4。從表中可以看出，本方法在三種空白飼料中的平均回收率范圍為76.6%～107.0%，符合分析的要求。變異系數范圍在10%以下，表明方法符合痕量分析的精密度要求。

表2 豬飼料回收率實驗及精密度

表3 禽飼料回收率實驗及精密度

表4 魚飼料回收率實驗及精密度

3 討論

3.1 提取條件的選擇 氯烯雌醚可以用甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑提取，結果表明，甲醇、乙腈、丙酮三種溶劑提取效率相當,乙酸乙酯提取效率較低。但乙腈比甲醇、丙酮所提取得到的干擾雜質要少，因此選用乙腈作為提取溶劑。

對乙腈的用量也進行了比較，當選用20 mL時，雖然對高添加濃度的回收率較好，但此時配合飼料添加較低濃度（0.5 mg/kg）儀器響應不明顯，經過優化將提取溶劑選擇在10 mL，減少對待測物質的稀釋。此外，當預混合飼料中添加氯烯雌醚的量超過200.0 mg/kg時，固相萃取柱吸附可能過載，致使回收率開始下降，因此需將提取液稀釋后再進行凈化。

3.2 凈化條件的選擇 本方法采用C18固相萃取柱。通過向提取液中加入等倍的水來調節提取液的溶液強度，進而使待測物質有效地吸附在固相萃取柱上，用氨水淋洗水溶性雜質，從而達到分離凈化的目的。經實驗優化用5%的氨水溶液能更好的除去雜質，其結果并不影響回收率。本實驗還做了甲醇、乙腈和丙酮三種溶劑的洗脫效果進行了比較，這三種溶劑均能定量洗脫被測物，因為色譜流動相采用甲醇，所以本方法采用甲醇為洗脫劑，得到的色譜峰對稱性更好。甲醇的用量對回收率有影響，用量太少，洗脫不完全，用量太多，洗脫時間長，本方法選用3 mL甲醇為洗脫試劑，效果最好，標準品過柱率可達96.2%。

3.3 色譜檢測波長的選擇 已報道的氯烯雌醚測定方法中波長均為247 nm。本實驗用紫外分光光度計對氯烯雌醚的紫外吸收光譜進行了測定。在200～400 nm之間，氯烯雌醚的紫外最大吸收波長分別位于247 nm處與307 nm處，如下圖1所示。

圖1 氯烯雌醚紫外吸收光譜圖

當實驗選擇247 nm為分析波長時，雖然此時氯烯雌醚有最大的紫外吸收，檢測靈敏度很高，但是由于飼料基質復雜，多數雜質在247 nm附近也存在強烈的紫外吸收，進而對氯烯雌醚的測定造成嚴重的干擾，較低含量的氯烯雌醚在測定時被雜質所掩蓋，分離度大大降低，極大地影響了實驗測定的檢測限。當實驗選擇307 nm為分析波長時，盡管氯烯雌醚在此時的紫外吸收不是最強，但此時飼料中多數雜質在此處沒有紫外吸收且飼料中常見藥物添加劑未見干擾。因此，本實驗選擇307 nm作為測定波長。

4 結論

本實驗建立的飼料中氯烯雌醚的測定方法具有較高的靈敏度、準確度和精密度，且回收率較高。樣品的提取和凈化方法操作簡單，易于掌握，適用于飼料中違禁藥物氯烯雌醚的檢測。